東北苦菜UPLC 指紋圖譜建立及化學模式識別

姚廣哲，馬文娟，賈 琪，歐陽慧子，常艷旭，何 俊?

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

東北苦菜為菊科苦苣菜屬植物變色苦菜Ixeris vesicolorDC.的干燥全草。在2015 年第20 號公告中，吉林省食品藥品監督管理局將1977 年版《吉林省藥品標準》 中的北敗醬修訂為東北苦菜［1］。東北苦菜味苦、性寒，具有清熱解毒、清癰、化瘀排膿等功效，臨床上常用于腸炎、急性咽炎、產后瘀血腹痛、急性細菌性痢疾等疾病的治療［2-4］。據相關報道［5-6］，東北苦菜中主要含有黃酮類、多糖類、揮發油和有機酸類等成分，但僅測定單一成分（綠原酸）的含有量，并不能有效的對其進行質量控制。因此，需要建立高效、快速的分析檢測方法，以便能夠更加全面的評價東北苦菜藥材的質量。

中藥指紋圖譜是能夠標示化學成分特征的色譜圖，其中潛藏著大量數據和變量，對其進行挖掘和評價，可以有效的反映出中藥內在的化學成分信息。但目前對中藥成分的處理僅使用相似度評價系統，存在一定的弊端，不能多層次、全方面地對藥材進行整體分析，很難準確地評價藥材的內在真實質量［7-8］。化學模式識別方法能對中藥指紋圖譜信息進行深入分析，快速篩選出需要重點關注的標志性成分，能有效的彌補指紋圖譜評價方法中的不足，將二者有機結合，對中藥的質量在整體性的基礎上得以有效的控制，更快速的識別出中藥復雜成分信息，達到區分藥物質量差異的目的［9-10］。因此，本實驗采用UPLC 法建立東北苦菜指紋圖譜，并結合化學模式識別方法對所得指紋圖譜進行綜合分析，判斷結果能直觀地反映不同產地樣品之間的質量差異，以期為東北苦菜藥材的質量評價研究提供參考。

1 材料

Agilent1290 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q 超純水制備儀（天津信睿生物科技有限公司）；AS 60/220.R2 型天平（十萬分之一，蘇州培科實驗室儀器科技有限公司）；G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）；5424R 型高速控溫離心機（德國Eppendorf 公司）。對照品綠原酸（批號MUST-18030620）、異槲皮苷（批號MUST-17051005）、木犀草苷（批號 MUST-17121210）、木犀草素（批號MUST-17102605）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；咖啡酸（批號110885-200102）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）；超純水由Milli-Q 制備。

東北苦菜采自吉林省不同地區，經天津中醫藥大學何俊研究員鑒定為菊科苦苣菜屬植物變色苦菜Ixeris vesicolorDC.的干燥全草。藥材經粉碎后，過3 號篩，保存于天津中醫藥大學中醫藥研究院。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 CORTECS C18柱（2.1 mm ×150 mm，1.6 μm）；流動相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，90%～81.5% A；8～20 min，81.5%～81.3% A；20～25 min，81.3%～81.3% A；25～35 min，81.3%～60% A；35～40 min，60%～40%A；40～50 min，40%～25%A）；體積流量0.1 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL；檢測波長 1～15 min，327 nm；15～50 min，360 nm。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱定對照品（綠原酸、木犀草素、異槲皮苷、木犀草苷、咖啡酸）各5 mg，加甲醇溶解并定容于5 mL 量瓶中，配制成質量濃度為1 mg/mL 的貯備液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取東北苦菜粉末0.1 g，加甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中，超聲提取（300 W，50 kHz）30 min，靜置室溫后，加甲醇補足至刻度線，搖勻，14 000 r/min 高速離心10 min，吸取上清液，微孔濾膜過濾，取續濾液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取樣品S4 6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，測得各共有色譜峰相對保留時間及峰面積RSD 達到規定要求，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 精密稱取樣品S4 6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，測得各共有色譜峰相對保留時間及峰面積RSD 達到規定要求，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 對樣品S4 供試品溶液進行精密吸取，在“2.1”項條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h 進樣，測得各共有色譜峰相對保留時間及峰面積RSD 達到規定要求，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5 結果與分析

2.5.1 指紋圖譜建立及相似度分析 使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件對所得的不同批次藥材的指紋圖譜數據進行分析，以S4 為參照色譜圖，采用多點校正法建立指紋圖譜［11］，得到10 個東北苦菜指紋圖譜見圖1，從該軟件分析得出，10 批東北苦菜樣品相對標準指紋圖譜（R）的相似度均在0.953 以上。結果表明，各產地的東北苦菜指紋圖譜具有較高的一致性。相似度分析結果見表2。

2.5.2 色譜峰指認 本研究根據相對保留時間標定特征指紋峰，通過對照品對各共有色譜峰進行指認，最終共確認了5 個色譜峰，分別為2 號峰（綠原酸）、3 號峰（咖啡酸）、11 號峰（異槲皮苷）、12 號峰（木犀草苷）、19 號峰（木犀草素），結果見圖2。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 10 批樣品相似度Tab.2 Similarities of ten batches of samples

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.6 化學模式識別方法

2.6.1 聚類分析 本研究應用SPSS 24.0 軟件，以共有峰的相對峰面積為變量，對東北苦菜樣品的數據進行聚類分析，方法為組間平均連接法，度量標準為歐氏距離［12］，結果見圖3。當距離刻度為25 時，10 批樣品主要分為2 大類，S9 為第1 類，S10、S3、S4、S7、S1、S8、S5、S6、S2 為 第2 類。

圖3 10 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of ten batches of samples

2.6.2 主成分分析 本研究中的變量為指紋圖譜中所得到的共有峰的峰面積，以此構建10×19 的原始數據矩陣，并使用變量統計分析軟件（SIMCA14.1）對10 批東北苦菜樣品進行主成分分析，Par 作為標度化方式，繪制出主成分分析圖，見圖4。結果表明，不同批次的東北苦菜樣品呈現出明顯的分類，證實了聚類分析的結果。圖5表明，載荷圖中的每一個點表示為一個色譜峰，其與原點（0，0）距離的遠近，代表該色譜峰對樣品整體分布貢獻程度的大小［13-14］。2 號、12 號和13 號色譜峰在坐標系中距離原點較遠，表明其對東北苦菜藥物的整體質量起到了重要影響作用。

圖4 10 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for ten batches of samples

圖5 10 批樣品主成分分析載荷圖Fig.5 Load scatter diagram of ten batches of samples

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）本研究采用有監督的OPLS-DA 模型進一步對樣品的數據進行分析，得到各批次樣品間的差異性成分，見圖6。由模型分析驗證參數可知，結實率參數R2X 為0.871，區分參數R2Y 為0.984，預測參數Q2 為0.748，以上數據均大于0.5，表明模型穩定并且具有較好的預測準確性［15］。為進一步篩選出對上述樣品分類貢獻較大的成分，本研究以變量投影重要度（Variable Importance for the Projection，VIP）＞1.0 為篩選標準［16］，對數據進行處理分析。共得到3 個有意義變量，按照變量投影重要度值大小依次為2 號峰（綠原酸）＞12 號峰（木犀草苷）＞13 號峰，見圖7。這些成分是10 批樣品之間產生差異的主要原因，具有一定的標志性作用，該結果與主成分分析中載荷圖的分析結果一致。為了更加全面、高效地評價藥物質量，在以后對東北苦菜的研究中應重點關注上述成分的質量變化。

圖6 10 批樣品OPLS-DA 分析散點圖Fig.6 Scatter diagram of OPLS-DA of ten batches of samples

3 討論

實驗通過對東北苦菜藥材進行全波長DAD 檢測器掃描，比較不同波長下的圖譜信息發現，綠原酸在360 nm 處的吸收值遠遠低于327 nm 處，其他成分在360 nm 均有較好的吸收值，為了不影響各成分的紫外檢測，且滿足各成分在最大吸收波長范圍內均有穩定的紫外吸收，因此，選用327、360 nm為檢測波長［17-18］。建立了東北苦菜的UPLC指紋圖譜，并對10 批樣品進行了相似度評價，結果顯示10 批樣品相似度均在0.953 以上；圖譜中有19 個共有峰，標定了5 個化合物，經指認為綠原酸、咖啡酸、異槲皮素、木犀草苷、木犀草素。

圖7 10 批樣品各成分VIP 圖Fig.7 VIP diagram of various constituents from ten batches of samples

為了改進相似度評價系統對指紋圖譜數據處理的不足，采用化學模式識別技術對指紋圖譜的數據進行分析，可以更加客觀的評價中藥真偽與優劣［19-20］。本實驗采用指紋圖譜相似度評價和化學模式識別技術相結合的方法對不同產地的東北苦菜進行研究，3 種分析結果相互驗證，系統地闡明東北苦菜藥材內在質量特征，以期為今后其質量控制提供參考。