健脾化濕顆粒對大鼠結腸上皮細胞OCLN、AQPs 及平滑肌細胞cAMP、AC 的影響

王迎寒，劉玉玲，陳光暉，胡 楠，張曉峰

（承德醫學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以間歇發作或持續存在的腹痛或腹部不適，并伴排便習慣或大便性狀改變為主要臨床特點，而又缺乏形態學或生化異常等可用器質性疾病解釋的功能性腸病。根據羅馬Ⅳ診斷標準，其病程至少半年，且近3 個月內每周至少1 d 出現相關癥狀［1］。根據臨床癥狀可將IBS 分為腹瀉型（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS）、便秘型（constipation-predominant irritable bowel syndrome，C-IBS）、混合型（mixed bowel habits irritable bowel syndrome，M-IBS）、不定型（Unclassified irritable bowel syndrome，U-IBS）［2］，其中以D-IBS 最為多見。近年來，D-IBS 發病率呈逐漸上升趨勢［3］，但其病理生理學機制尚未明確，與腸道動力異常、內臟敏感性、腸黏膜滲透性的改變及腸道微生物改變、自主神經功能障礙、免疫激活、腦-腸軸調節功能異常等有關，為多方面因素共同作用的結果［4］。就D-IBS 而言，腸運動增加，腸黏膜通透性增強是腹瀉產生的重要原因；而腸黏膜的滲透性與腸上皮細胞密切相關，腸道動力與腸平滑肌細胞密切相關。健脾化濕顆粒源于臨床，具有理氣健脾、化濕止瀉作用，用于治療D-IBS。前期實驗結果亦表明，健脾化濕顆粒能調節腸動力，減輕腹瀉癥狀，因此，本研究著眼于結腸上皮細胞和平滑肌細胞，擬從上皮細胞緊密連接蛋白（Occludin，OCLN）、水通道蛋白（aquaporins，AQPs）及平滑肌細胞中環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）著手，研究健脾化化濕顆粒止瀉作用的機制。

1 材料

1.1 細胞株 結腸上皮細胞株及結腸平滑肌細胞株均購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 藥物 健脾化濕顆粒由炙黃芪、益智仁、炒白術、茯苓、砂仁、烏藥、陳皮、炒白芍、防風、炙甘草組成；采用傳統水煎煮法、乙醇洗滌沉淀、減壓濃縮、真空干燥，以干膏粉∶乳糖=1∶1 比例濕法制粒而成；薄層色譜法鑒別防風、陳皮、烏藥、炙甘草、白術五味藥材；高效液相色譜法檢測炙黃芪和炒白芍的含有量，每克顆粒中炙黃芪不得少于0.15 mg/g（以黃芪甲苷計），炒白芍不得少于0.75 mg/g（以芍藥苷計）［5］。健脾化濕顆粒（批號201610）由承德醫學院中藥研究所制備。氯化乙酰膽堿（上海士鋒生物科技有限公司，批號16091902）；鹽酸阿托品（天津金耀氨基酸有限公司，批號1512241）。

1.3 試劑 高糖DMEM（美國Gibco 公司，批號8115063）；胎牛血清（德國Bioclot 公司，批號1964）；大鼠cAMP 酶聯免疫試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號Oct 2016）；大鼠AC 酶聯免疫試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號Oct 2016）；CCK8（500 次）試劑盒（日本同仁化學研究所，批號JE603）；兔抗大鼠緊密連接蛋白抗體（Occludin，北京博奧森生物技術有限公司，批號AF09265505）；兔抗大鼠水通道蛋白3 抗體（AQP3，北京博奧森生物技術有限公司，批號AE042437）；兔抗大鼠水通道蛋白4 抗體（AQP4，北京博奧森生物技術有限公司，批號AF09221494）；0.25% 胰酶（含EDTA，北京索萊寶科技有限公司，批號20150423）；山羊抗兔IgGHRP 二抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號AF11285098S）；兔抗大鼠β-actin 抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號AF04158601）；BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，貨號P1511）；還原型5×SDS 上樣緩沖液（碧云天生物技術研究所，貨號P0015）；脫脂奶粉（美國BD 公司，批號4239539）；化學發光試劑A 和B（美國 Thermo Scientific 公司，批號 P1020）；TEMED（美國Sigma 公司，批號M146）；30%丙烯酰胺（碧云天生物技術研究所，批號20161021）；過硫酸銨（北京索萊寶科技有限公司，批號1024D0313）；預染Marker（美國Thermo Scientific公司，批號00389282）；PVDF 膜（美國Millipore公司，0.45 μm）。

1.4 儀器 YT-875SB 型醫用凈化工作臺（蘇州蘇杭實驗動物設備廠）；MCO-15AC CO2培養箱（日本三洋公司）；HZQ-X100 恒溫震蕩培養箱（江蘇同君儀器科技有限公司）；BH-2 型顯微鏡及攝像裝置（日本Olympus 公司）；Multiskan MK 3 酶標儀（美國Thermo Labsystems 公司）；LD4-2A 低速離心機（北京京立離心機有限公司）；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；Velocity18 r 臺式高速冷凍離心機（瑞士Dynamica公司）；WD-9405B 水平搖床、DYY-7C 轉印電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；CP214 電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；DYCZ-40D 迷你轉印電泳儀、DYCZ-24DN 迷你雙垂直電泳儀（北京市六一儀器廠）；Tanon 6100 電化學發光成像系統（北京原平皓生物技術有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 收到細胞株后，鏡下觀察，上皮細胞呈不規則卵圓形，平滑肌細胞呈梭形，均已長滿90%瓶底。常規方法按1∶3 比例進行傳代擴增，調細胞濃度至5×105/mL 接種于培養瓶中，37 ℃、95% O2和5% CO2條件下培養。24 h 后換液，以后每3 d 更換培養基1 次，期間用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。待細胞長滿90%培養瓶底時傳代，部分凍存，將第8 代細胞用于實驗。

2.2 健脾化濕顆粒溶液配制 精確稱定200 mg 健脾化濕顆粒粉（未加輔料），加入2 mL PBS 緩沖液，充分溶解，無菌濾膜過濾除菌，質量濃度為100 mg/mL，4 ℃保存備用。用時按比例稀釋。

2.3 檢測健脾化濕顆粒處理后上皮細胞存活率 采用CCK-8 法。收集長滿培養瓶80%融合度的第7代結腸上皮細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養24 h 后，加入不同濃度的健脾化濕顆粒溶液，使健脾化濕顆粒的質量濃度為1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL，每個質量濃度3 個復孔，孵育24、48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續孵 育2 h，用酶標儀于450 nm處測吸光度值 ［OD（45 nm）］。重復3次，選擇適宜的健脾化濕顆粒濃度。

2.4 檢測健脾化濕顆粒處理后上皮細胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表達 采用Western blot 法。收集長滿培養瓶80%融合度的第7 代結腸上皮細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，接種到6 孔板中，每孔3 mL，培 養24 h 后，加入健 脾化濕顆粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每個濃度3 個復孔，孵育24 h 后，棄去培養液，PBS 緩沖液洗3 次，棄去，將培養板倒扣在吸水紙上吸干液體，每孔加入200 μL 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min，經常來回搖動使細胞充分裂解。裂解完后，用干凈的刮棒迅速將細胞刮下，然后將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL 離心管中。4 ℃，12 000 r/min 離心5 min。將離心后的上清分裝0.5 mL 的離心管中，每管50 μL，-20 ℃保存，重復3 次。用BCA 蛋白定量試劑盒檢測各樣本蛋白濃度，各樣本取50 μg蛋白量上樣（5%濃縮膠，12.5%分離膠），電泳至溴酚蘭剛跑出邊緣終止（濃縮膠80 V，分離膠120 V）。400 mA 恒流轉膜3 h，一抗（OCLN 抗體1∶200，AQP3 抗體1∶200，AQP4 抗體1∶1 000；β-actin 抗體1∶2 000）4 ℃孵育過夜，室溫下二抗（1∶2 000）孵育2 h，滴加電化學發光液，1 min后用Tanon 6100 電化學發光成像系統曝光拍照，曝光時間10 s。圖片用WD-94BA 凝膠成像系統自帶軟件進行半定量分析，測定目的條帶光密度值。各目的蛋白的光密度與β-actin 條帶光密度的比值乘以100%作為該蛋白表達水平參數。

2.5 檢測健脾化濕顆粒處理后結腸平滑肌細胞舒縮 收集長滿培養瓶80%融合度的第7 代結腸平滑肌細胞，調整濃度為1×104/mL，接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養24 h 后，加入健脾化濕顆粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每個濃度3 個復孔，并設空白對照，孵育24 h 后，用胰酶消化，收集各孔細胞，調整細胞濃度為1×104/mL，加入1×10-7mmol/mL Ach 或0.18 mg/mL 阿托品，使終濃度Ach 為1×10-8mmol/mL，阿托品為60 μmol/L，孵育30 s，最后加入30 μL 2.5%戊二醛終止反應，各組分別取20 μL 細胞懸液滴于載波片上，作為一個檢體，于倒置顯微鏡下觀察，每個檢體隨機測量邊續視野下30 個完整細胞的長度，計算細胞平均長度，重復3 次。

2.6 檢測健脾化濕顆粒處理后結腸平滑肌細胞cAMP、AC 的水平 收集長滿培養瓶80% 融合度的第7 代結腸平滑肌細胞，調整細胞濃度為5×105/mL，接種到24 孔板中，每孔200 μL，培養24 h后，加入健脾化濕顆粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每個濃度3 個復孔，并設空白對照，孵育24 h后，加入1×10-7mmol/mL Ach 或0.18 mg/mL 阿托品，使終濃度 Ach 為 1×10-8mmol/mL，阿托品 為60 μmol/L，孵育30 s，快速棄去培養上清，PBS緩沖液 洗3 次，然后每孔加入 PBS 緩沖液400 μL，反復凍融3 次，-80 ℃保存，重復3 次。嚴格按照ELISA 試劑盒要求檢測大鼠結腸平滑肌細胞內cAM、AC 水平。

2.7 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。若方差齊則采用LSD 檢驗，若方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度的健脾化濕顆粒對結腸上皮細胞存活率的影響 健脾化濕顆粒質量濃度≤1 mg/mL時，結腸上皮細胞存活率≥90%，且24 h、48 h 趨勢相同，差異無統計學意義。確定健脾化濕顆粒質量濃度分別為1、0.5、0.25 mg/mL，孵育時間為24 h，做后續研究。見圖1。

3.2 健脾化濕顆粒對結腸上皮細胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表達的影響 與正常組比較，健脾化濕顆粒（1、0.5、0.25 mg/mL）上皮細胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1、圖2。

表1 健脾化濕顆粒對結腸上皮細胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表達的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells（，n＝6）

表1 健脾化濕顆粒對結腸上皮細胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表達的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells（，n＝6）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖2 健脾化濕顆粒對結腸上皮細胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表達的影響Fig.2 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells

3.3 健脾化濕顆粒對結腸平滑肌細胞舒縮的影響 健脾化濕顆粒（1、0.5、0.25 mg/mL）能增加結腸平滑肌細胞長度（P＜0.05，P＜0.01）；加入Ach 干預后，結腸平滑肌細胞長度減小（P＜0.01），而健脾化濕顆粒（1、0.5、0.25 mg/mL）能顯著抑制Ach 引起的平滑肌細胞收縮（P＜0.05，P＜0.01）；加入阿托品干預后，結腸平滑肌細胞長度增加，健脾化濕顆粒（1、0.5 mg/mL）與阿托品協同作用促進平滑肌細胞舒張（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

3.4 健脾化濕顆粒對結腸平滑肌細胞cAMP、AC的影響 與正常組比較，健脾化濕顆粒（1、0.5 mg/mL）可降低結腸平滑肌細胞內cAMP、AC 的水平（P＜0.05，P＜0.01）；Ach 升高結腸平滑肌細胞內cAMP、AC 的水平（P＜0.01）；健脾化濕顆粒（1、0.5 mg/mL）能抑制Ach 引起的平滑肌細胞內cAMP、AC 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與阿托品有協同作用降低平滑肌細胞內cAMP、AC水平（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表2 健脾化濕顆粒對結腸平滑肌細胞長度的影響（μm，，n＝9）Tab.2 Effects of JHG on the length of colonic smooth muscle cells（μm，，n＝9）

表2 健脾化濕顆粒對結腸平滑肌細胞長度的影響（μm，，n＝9）Tab.2 Effects of JHG on the length of colonic smooth muscle cells（μm，，n＝9）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，##P ＜0.01；與Ach 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與阿托品組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表4 健脾化濕顆粒對結腸平滑肌細胞cAMP、AC 的影響（，n＝9）Tab.4 Effects of JHG on cAMP and AC in colonic smooth muscle cells（，n＝9）

表4 健脾化濕顆粒對結腸平滑肌細胞cAMP、AC 的影響（，n＝9）Tab.4 Effects of JHG on cAMP and AC in colonic smooth muscle cells（，n＝9）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與Ach 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與阿托品組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 討論

IBS 是臨床上常見的功能性消化道疾病，以D-IBS較為多見，好發于青壯年，具有發病率高和反復發作的特征，給患者的工作和生活帶來不便，且消耗大量的醫療資源。D-IBS 的病理生理學機制尚未明確，D-IBS 的發生與腸道動力異常、內臟敏感性異常、腦腸軸功能異常等因素密切相關，并通過神經系統、免疫系統、內分泌系統等多方面的綜合作用導致腸道平滑肌運動障礙和水液代謝功能紊亂［6］。現代醫學認為，水液的吸收部位主要在腸道，消化道內大部分水分被小腸吸收，不能被小腸吸收的水液進入結腸。如果進入結腸的水液超過了其吸收能力或者結腸吸收水液的能力下降，都會導致糞便中的水液增加，發生腹瀉［7］。因此，AQPs表達減少，不能有效的轉運水液；腸運動加快，使結腸不能充分吸收水液，均可以導致腹瀉的發生。

AQPs 又名水孔蛋白，廣泛分布于機體中，目前在消化道已發現有9 種AQPs 表達。它們分布于腸黏膜中，主要介導水液的跨膜轉動，以便維持腸道細胞內外環境穩定。研究發現，AQP3 可通過介導腸腔與血管之間的水液轉動調節結腸中的糞便含水量，其作用可被HgCl2或CuSO4抑制［8］；血管活性腸多肽可通過cAMP-PKA 依賴性途徑上調AQP3 的表達，從而改變腸黏膜對水的通透性，調節水的跨膜運動，影響胃腸道分泌、吸收功能［9］。AQP4 主要位于結腸上皮細胞的基底外側膜，同樣參與了跨細胞水液轉動，在cAMP-PKA 信號通路介導下，AQP4 異常表達在D-IBS 的病理生理過程中起關鍵作用［10］。

一直以來，胃腸動力異常作為IBS 的主要病理生理之一。胃腸運動依賴于胃腸道平滑肌的收縮和舒張，并受腸神經系統和中樞神經系統共同調控。隨著科學技術的不斷進步，對胃腸運動的研究已經從宏觀的在體和離體腸管實驗轉到細胞層面，甚至是某個信號通路的研究。平滑肌細胞是胃腸運動的基本單位，其上分布著各種類型的受體，如激動型受體中的M 受體、5-HT 受體等，激活此類受體，可引起細胞的收縮，使腸道運動加快。

cAMP 被稱為細胞內的第二信使，在G 蛋白偶聯信號通路中起重要的調控作用，參與人體的各種活動。在胃腸道，cAMP 調控作用涉及黏膜層、肌層以及腸神經系統，對胃腸道的運動功能、內臟感覺及分泌功能都具有非常重要的調節作用［11］。當細胞受到外界刺激時，首先激活Gs 蛋白，再激活AC，從而產生cAMP，生成的cAMP 可進一步激活蛋白激酶A，進而影響多種蛋白的磷酸化及離子通道的激活或失活，使細胞對外界刺激產生相應反應。在結腸平滑肌中，可由M 受體活化而增加。

健脾化濕顆粒配方來源于臨床，該方具有理氣健脾、祛濕止瀉之效，主要用來治療D-IBS，療效確切。本課題組前期研究［12-18］結果顯示，健脾化濕顆粒可以降低D-IBS 大鼠結腸運動及內臟敏感性，其作用機制可能與調節腦腸軸功能，改善腦腸肽的水平及其受體的表達有關。在本實驗中，應用CCK-8 試劑盒檢測不同濃度健脾化濕顆粒對上皮細胞存活率的影響，確定1、0.5、0.25 mg/mL 為后續實驗用質量濃度，孵育時間為24 h；3 個濃度的健脾化濕顆粒可顯著升高上皮細胞OCLN、AQP3、AQP4 表達；均可顯著增加結腸平滑肌的長度，顯著抑制Ach 引起的平滑肌細胞收縮及協同阿托品促進平滑肌細胞舒張（P＜0.05，P＜0.01）；1、0.5 mg/mL 健脾化濕顆粒可顯著降低平滑肌細胞內AC、cAMP 的水平，抑制由Ach 引起的平滑肌細胞內AC、cAMP 水平的升高及協同阿托品引起平滑肌細胞內AC、cAMP 水平的降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示健脾化濕顆粒可通過增加上皮細胞OCLN、AQP3、AQP4 表達增強腸道對水液的主動吸收；亦可通過調節平滑肌細胞內AC、cAMP 的水平，從而改善平滑肌運動功能，此過程中有M受體的參與。結合前期研究結果，課題組分析健脾化濕顆粒的作用機制并不單一，對上皮細胞和平滑肌細胞的作用也不止于此，因此，在后續研究工作中，課題組還需要進一步擴展思路，深度挖掘健脾化濕顆粒治療D-IBS 的作用機制。