桑皮素對(duì)人宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖與凋亡的影響

左亞奇，高志紅，龐 策，劉賽娜，張曉麗，孫轉(zhuǎn)友，甄 攀

（河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

桑皮素，又名桑根皮素、桑白皮素，是一種異戊二烯基取代的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)桑皮素為桑白皮的主要藥用成分，常被用作對(duì)照品對(duì)桑白皮進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)，具有抗 菌［1］、抗氧化［2］、降 血糖［3］及抗腫瘤［4］等多種生物活性，尤其是在抗腫瘤方面。鄧潔等［5］將桑皮素作用于STAT3 磷酸化下的卵巢癌SKOV3 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)桑皮素顯著抑制SKOV3 細(xì)胞的增殖，并降低Cyclin D1 蛋白的表達(dá)；Dat 等［6］通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桑葉中提取的桑皮素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用；有研究發(fā)現(xiàn)桑皮素是STAT3 通路中的一個(gè)有效的抑制劑，對(duì)肝癌和胰腺癌細(xì)胞具有抑制作用，另有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明桑皮素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用并且對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響［7-9］。本實(shí)驗(yàn)主要研究桑皮素抑制人宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖作用，以及初步探討其促進(jìn)Hela 細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 桑皮素分離自川桑枝（采集于中國(guó)云南金平縣，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馬林副研究員鑒定為Morus notabilis），結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。川桑樹枝20 kg，粉碎，用95%乙醇浸泡，回流提取3 次，提取液合并，減壓濃縮得浸膏。將浸膏溶解后以硅膠（100～200 目）拌樣并干燥，分別用石油醚（PE，60～90 ℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮依次洗脫。二氯甲烷部分濃縮得浸膏200 g，浸膏以D101 大孔吸附樹脂拌樣并干燥，用乙醇水梯度洗脫（30%、80%、90%乙醇），80%乙醇部分得浸膏29 g，然后依次用硅膠（200～300 目）柱色譜（丙酮-石油醚梯度洗脫）、反相C18柱色譜（甲醇-水梯度洗脫）、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 柱色譜（乙醇洗脫）、制備型RP-HPLC（甲醇-水或乙腈-水洗脫）等分離純制，得到化合物桑皮素，且含有量為1.07 mg/g，純度為99.6%。

圖1 桑皮素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of morusin

1.2 細(xì)胞株 Hela 細(xì)胞取自河北北方學(xué)院生命科學(xué)中心科技樓三樓307 室細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑 胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)1616496）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20180511）；Bax 抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào) GR239643-1）；Bcl-2 抗體（英 國(guó)Abcam 公司，批號(hào)GR25072-1）；Hoechst33258 染色試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)102017180427）；抗熒光淬滅劑（北京碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)010518180509）；β-actin 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AG05127919S）；MTT 試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20180428）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20171113）；5-氟尿嘧啶（5-FU，海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)H31020593）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela 細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液及傳代培養(yǎng)，正常情況下細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

2.2 藥物配制 精密稱取桑皮素2.10 mg，加入0.05 mL 二甲基亞砜混勻震蕩，使藥物全部溶解，然后用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋成各用藥濃度，放置于4 ℃冰箱保存，保質(zhì)期10 d。實(shí)驗(yàn)前取1 支5-FU（10 mL/支，0.25 g），用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋配制陽(yáng)性藥（192 μmol/L），放置于4 ℃冰箱保存。

2.3 Hela 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化觀察 ①倒置顯微鏡觀察Hela 細(xì)胞的形態(tài)，用10、15、20 μmol/L桑皮素作用Hela 細(xì)胞24 h 后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。②透射電鏡觀察Hela 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 Hela 細(xì)胞，經(jīng)不同濃度（0、15 μmol/L）桑皮素作用24 h 后，胰酶消化2 min，離心（1 500 r/min，5 min），置于1.5 mL離心管內(nèi)；2.5% 的戊二醛固定細(xì)胞，PBS 清洗3次；1%鋨酸對(duì)Hela 細(xì)胞進(jìn)行固定，PBS 清洗細(xì)胞3 次；丙酮梯度脫水；浸透在丙酮和包埋液（1∶1）的混合液中，于37 ℃溫箱中過(guò)夜；包埋，修塊，切片，電子染色，鏡下觀察。③掃描電鏡觀察Hela 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hela 細(xì)胞，經(jīng)不同濃度（0、15 μmol/L）桑皮素作用24 h后，經(jīng)胰酶消化2 min，計(jì)數(shù)后進(jìn)行鋪板，待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，PBS 清洗3 次，5 min/次，2.5%的戊二醛固定1 h，PBS 清洗3 次，5 min/次，采用酒精梯度脫水，叔丁醇浸泡30 min，置于-20 ℃冰箱里變?yōu)楣腆w，冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，噴金，鏡下觀察。

2.4 MTT 法檢測(cè)桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞增殖抑制作用取處于對(duì)數(shù)期并生長(zhǎng)良好的Hela 細(xì)胞，胰酶消化后，加入培養(yǎng)基輕輕吹打混勻單細(xì)胞懸液，均勻加入96 孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，加入桑皮素（2.5、5、7.5、10、15、20、25 μmol/L），作用24、48 h 后，終止培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置正常組、DMSO組（含0.1% DMSO 的等量培養(yǎng)基）及陽(yáng)性對(duì)照組（5-FU，192 μmol/L），并分別設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。于每孔中加入10 μL MTT 試劑，培養(yǎng)箱中靜置4 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處吸光度值 ［OD（490 nm）］，并計(jì)算IC50。

2.5 Hoechst 染色法觀察Hela 細(xì)胞的凋亡 取處于對(duì)數(shù)期并生長(zhǎng)良好的Hela 細(xì)胞，胰酶消化后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL，將蓋玻片放置于6 孔板中，并每孔加入2 mL 單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。次日加入桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）作用24 h 后，終止培養(yǎng)。爬片完成后用PBS 清洗爬片3 次，3 min/次，丙酮室溫固定20 min，PBS 清洗。暗室內(nèi)滴加Hoechst 33258 染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，PBS 清洗?？篃晒獯銣鐒┓馄R下觀察并拍照。

2.6 Western blot 檢測(cè)Hela 細(xì)胞Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá) 收集經(jīng)濃度為0、10、15、20 μmol/L 桑皮素處理24 h 及經(jīng)15 μmol/L 桑皮素分別處理0、24、48 h 后的Hela 細(xì)胞，PBS 清洗，1 700 r/min離心收集細(xì)胞。加入0.5 mL 蛋白裂解液，混勻靜置5 min，加1 mL 蛋白抽 提試劑，混勻靜 置10 min，10 000 r/min、4 ℃高速離心15 min，保留中間蛋白膜，加1 mL 無(wú)水乙醇洗滌沉淀，10 000g、4 ℃離心3 min，去掉無(wú)水乙醇室溫干燥蛋白。加入100 μL 2% SDS 溶解總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液蛋白煮沸，冷卻后置于4 ℃冰箱保存，配制SDS 聚丙烯酰胺凝膠。每孔分別加5 μL Maker，正常組蛋白，樣品蛋白，電泳1 h，轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，PBST 洗膜3 次，10 min/次，加入一抗（1∶1 000）覆蓋，4 ℃過(guò)夜；次日，PBST 清洗3 次，加入二抗（1∶5 000）覆蓋，室溫孵育1 h，PBST 洗膜3 次，10 min/次，滴加發(fā)光液拍照，用Quantity one 測(cè)定條帶灰度值。

2.7 qRT-PCR 檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA 表達(dá) 消化洗滌對(duì)數(shù)期正常組和加藥組細(xì)胞，2 500g離心收集細(xì)胞，PBS 清洗3 次，去上清，加1 mL RNA 抽提試劑靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，上下顛倒，室溫靜置2 min，于4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，吸取上清至無(wú)酶離心管內(nèi)，加等體積異丙醇，混勻后室溫靜置10 min，于4 ℃下10 000 r/min離心10 min，保留沉淀，加1 mL 75% 滅酶乙醇，于4 ℃下7 500 r/min 離心5 min，保留沉淀并室溫干燥，加20 μL 無(wú)酶水溶解，取1 μL RNA 于NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度及純度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Bax、Bcl-2 及內(nèi)參引物β-actin的引物序列及長(zhǎng)度，見(jiàn)表1。對(duì)僅轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照Yu 等［10］方法。采用2-ΔΔCt方法對(duì)mRNA 的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

3.1.1 倒置顯微鏡觀察 桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）處理Hela 細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)由正常的六棱形逐漸皺縮變圓，細(xì)胞貼壁率降低，且有細(xì)胞穿孔現(xiàn)象，并且隨著桑皮素濃度的增高，該現(xiàn)象越明顯，見(jiàn)圖2。

3.1.2 透射電鏡觀察 用透射電鏡觀察0、15 μmol/L桑皮素組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)15 μmol/L桑皮素組細(xì)胞膜不完整，染色質(zhì)高度盤繞，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不完整，形成許多氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

3.1.3 掃描電鏡觀察 用掃描電鏡觀察0、15 μmol/L桑皮素組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)15 μmol/L桑皮素組細(xì)胞膜皺縮，細(xì)絲狀突起斷裂，表面呈不規(guī)則的塊狀，見(jiàn)圖4。

3.2 MTT 法檢測(cè)Hela 細(xì)胞增殖 與DMSO 對(duì)照組比較，不同濃度桑皮素（2.5、5、7.5、10、15、20、25 μmol/L）處理Hela 細(xì)胞24、48 h，均能抑制Hela 細(xì)胞增殖（P＜0.05），且呈濃度依賴性；其中桑皮素處理Hela 細(xì)胞24 h，IC50=17.2 μmol/L，見(jiàn)表2。

圖2 不同濃度桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）Fig.2 Effects of different concentrations of morusin on the morphology of Hela cells（×200）

圖3 桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響（透射電鏡）Fig.3 Effect of morusin on the microstructure of Hela cells（TEM）

圖4 桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響（掃描電鏡）Fig.4 Effect of morusin on the microstructure of Hela cells（SEM）

3.3 Hoechst 單染檢測(cè)Hela 細(xì)胞凋亡 不同濃度桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）處理Hela 細(xì)胞24 h 后，經(jīng)Hoechst33258 染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組細(xì)胞呈橢圓形和正常藍(lán)色；10 μmol/L桑皮素組細(xì)胞個(gè)別染色加深，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核呈致密濃染；15 μmol/L桑皮素組濃染細(xì)胞數(shù)量明顯增多，多數(shù)細(xì)胞核邊緣變鈍；20 μmol/L桑皮素組有部分細(xì)胞核出現(xiàn)破碎的現(xiàn)象，見(jiàn)圖5。

表2 桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制作用（，n＝6）Tab.2 Inhibition of Hela by morusin（，n＝6）

表2 桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制作用（，n＝6）Tab.2 Inhibition of Hela by morusin（，n＝6）

注：與同一時(shí)間DMSO 對(duì)照組比較，?P＜0.05。

圖5 不同濃度桑皮素對(duì)Hela 細(xì)胞早期凋亡的影響Fig.5 Effects of different concentrations of morusin on early apoptosis of Hela cells

3.4 Western blot 檢測(cè)Hela 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 不同濃度桑皮素（10、15、20 μmol/L）處理Hela 細(xì)胞24 h，與0 μmol/L 桑皮素比較，桑皮素（10、15、20 μmol/L）能顯著抑制Hela 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax 蛋白表達(dá)（P＜0.05）；15 μmol/L桑皮素作用Hela 細(xì)胞24、48 h，Hela 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白下調(diào)，Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表3～4、圖6。

圖6 Western blot 檢測(cè)桑皮素作用Hela 細(xì)胞后Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expressions of Bcl-2 and Bax in Hela cells treated with morusin by Western blot

表3 不同濃度桑皮素對(duì)Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）Tab.3 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

表3 不同濃度桑皮素對(duì)Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）Tab.3 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

注：與0 μmol/L 桑皮素組比較，?P＜0.05。

表4 15 μmol/L 桑皮素處理Hela 細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）Tab.4 Effects of 15 μmol/L morusin treatment to Hela cells at different times on the expression of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

表4 15 μmol/L 桑皮素處理Hela 細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響（，n＝3）Tab.4 Effects of 15 μmol/L morusin treatment to Hela cells at different times on the expression of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

注：與0 h 比較，?P＜0.05。

3.5 qRT-PCR 檢測(cè)Hela 細(xì)胞Bcl-2、BaxmRNA 表達(dá) 不同濃度桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）處理Hela 細(xì)胞24 h，與0 μmol/L 桑皮素比較，桑皮素（10、15、20 μmol/L）上調(diào)BaxmRNA 表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 mRNA 表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 不同濃度桑皮素對(duì)Bcl-2、 Bax mRNA 表達(dá)的影響（，n＝3）Tab.5 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax mRNA（，n＝3）

表5 不同濃度桑皮素對(duì)Bcl-2、 Bax mRNA 表達(dá)的影響（，n＝3）Tab.5 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax mRNA（，n＝3）

注：與0 μmol/L 桑皮素組比較，?P＜0.05。

4 討論

宮頸癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，較多發(fā)生在歐洲和非洲，臨床診治中宮頸癌的早期癥狀不甚明顯，患者多數(shù)表現(xiàn)為中晚期，而且預(yù)后效果不好［11］。目前在宮頸癌的常規(guī)治療中，常常以早中期的外科手術(shù)治療為主，同時(shí)以中晚期的放療和化療為輔助手段［12］。但是宮頸癌大都早期不易發(fā)現(xiàn)，而放化療在治療的同時(shí)對(duì)機(jī)體又有一定程度的損傷并增加了患者的痛苦。

黃酮類化合物廣泛存在于藥用植物中，不同的黃酮類化合物都表現(xiàn)出不同的抗腫瘤效果，并且有部分已被用于癌癥的治療中［13］。其中有些黃酮類化合物（如蛇葡萄素）被用于前列腺癌的防治研究并獲得不錯(cuò)的效果［14］。異戊二烯基黃酮作為黃酮化合物的一種，具有抑菌、消炎、抗氧化等作用［15］。

桑皮素是從桑樹根皮或者枝皮中提取分離得到的，廣泛存在于桑樹的各個(gè)部位中，特別是在桑樹的根皮中含有量最高，枝皮中的含有量次之［16-17］。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)其做了大量研究，發(fā)現(xiàn)桑皮素的藥理作用十分豐富，具有抑菌、抗炎及抗病毒等作用，并且具有一定的細(xì)胞毒性，對(duì)多種癌細(xì)胞均有抑制作用［18］。

本實(shí)驗(yàn)MTT 結(jié)果表明，桑皮素作用Hela 細(xì)胞24 h 后，IC50=17.2 μmol/L，且隨著桑皮素濃度的提高，效果越明顯。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組的細(xì)胞狀態(tài)良好呈六棱形，桑皮素組細(xì)胞皺縮變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，明顯可以看到細(xì)胞穿孔的現(xiàn)象，并且隨著桑皮素濃度的增高，細(xì)胞變化越明顯。透射電鏡結(jié)果顯示，15 μmol/L 桑皮素組細(xì)胞膜不完整，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損壞，出現(xiàn)許多氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。掃描電鏡結(jié)果顯示，15 μmol/L桑皮素組細(xì)胞膜皺縮，細(xì)絲狀突起斷裂，表面呈不規(guī)則的塊狀。

桑皮素作用于癌細(xì)胞的重要靶點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，最終使癌細(xì)胞走向死亡［19］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用Hoechst 單染檢測(cè)Hela 細(xì)胞凋亡，明顯地看到隨著桑皮素作用濃度升高，核染色逐漸加深，高濃度桑皮素作用下，細(xì)胞核裂解。

細(xì)胞凋亡與相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，藥物可以通過(guò)調(diào)控一個(gè)或多個(gè)基因來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡或者壞死。Bcl-2 蛋白家族成員可以通過(guò)調(diào)控線粒體途徑影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2 家族包括誘導(dǎo)凋亡的蛋白（Bax、Bak、Bid、Bim）以及抑 制凋亡 的蛋白（Bcl-2、Bcl-xL）。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bax 與Bak發(fā)生寡聚化，從胞質(zhì)聚集到線粒體的外膜上，與膜上電壓作用打開陰離子通路，使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C 等凋亡因子等釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，引起細(xì)胞死亡［20］。

為了驗(yàn)證桑皮素促進(jìn)Hela 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用Western blot 和qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)觀察Hela 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，桑皮素可能通過(guò)促進(jìn)Bax和抑制Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)宮頸癌Hela 細(xì)胞的凋亡，但是其作用機(jī)理尚不清楚，仍需要做進(jìn)一步的研究。綜上所述，桑皮素通過(guò)升高Bax 因子的表達(dá)和降低Bcl-2 因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞發(fā)生凋亡。