IP-RP-HPLC 法同時測定感冒清片中3 種成分

朱鏈鏈，王麗瓊

（1.樂山職業技術學院，四川 樂山 614000；2.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

感冒清片屬于抗感冒藥類中西藥復方制劑，由3 種西藥（對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏）和6 種中藥（南板藍根、大青葉、金盞銀盤、崗梅、山芝麻、穿心蓮葉）制成，該類制劑應用廣泛，但其不良反應問題也居高不下［1］，業界大多認為其原因是在臨床使用時易忽略所含化學成分，關鍵項目（如有關物質、含有量均勻度、溶出度）缺失，故建議對該類藥物進行再評價［2］。

文獻［3-8］報道，采用HPLC 法測定對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏單一或多種成分含有量，但鹽酸嗎啉胍保留弱，易受溶劑峰干擾，而在流動相中加入離子對試劑可使分離變好。本實驗建立離子對反相高效液相色譜（ion-pair reversephase high performance liquid chromatography，IP-RPHPLC）法同時測定感冒清片中對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏的含有量，并考察三者含有量均勻度，以期為該制劑質量標準提高提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置四元泵、DAD 檢測器）；XS205 電子天平、FE28 PH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）。

1.2 試劑與藥物 對乙酰氨基酚（100018-201610，質量分數99.9%）、鹽酸嗎啉胍（100483-200402，質量分數100%）、馬來酸氯苯那敏（100047-201507，質量分數99.7%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。感冒清片（廣東一片天醫藥集團制藥有限公司，批號171113、171208；廣東南國藥業有限公司，批號170606），每片含對乙酰氨基酚12 mg、鹽酸嗎啉胍12 mg、馬來酸氯苯那敏0.5 mg。甲醇為色譜純或分析純；磷酸、磷酸二氫鉀為分析純；辛烷磺酸鈉（離子對色譜試劑）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XTerraC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.02 mol/L磷酸二氫鉀（含0.005 mol/L 辛烷磺酸鈉，10%磷酸調節pH 至3.0）（B），梯度洗脫（0～20 min，10%～75% A；20～21 min，75%～10% A；21～26 min，10% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長215 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。由此可知，各成分分離度良好，理論塔板數按對乙酰氨基酚峰計為18 394，其他成分在三者保留時間上沒有色譜峰，不干擾測定。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品對乙酰氨基酚48.38 mg、鹽酸嗎啉胍47.74 mg，置于同一50 mL量瓶中，25%甲醇（pH=3.0）溶解；精密稱取馬來酸氯苯那敏對照品10.24 mg，置于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于上述50 mL 量瓶中，溶劑稀釋至刻度，作為貯備液。精密量取5 mL 于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品10 片，精密稱定質量，計算平均片重，研細，取約0.22 g（相當于12 mg 對乙酰氨基酚），置于25 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）超聲助溶，放冷，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例分別制備不含對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 定量限 精密稱取對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏對照品適量，25%甲醇（pH=3）溶解并分別稀釋成0.32、0.05、0.51 μg/mL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。結果，三者信噪比（S/N）分別為37.2、43.8、46.8（以氯苯那敏峰計）；以S/N=10，得定量限分別為0.09、0.01、0.11 μg/mL。

2.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液1、2、4、6、8 mL，置于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，得線標溶液，取其與對照品溶液共6 份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏峰面積RSD 分別為0.2%、0.2%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批本品（批號171113），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏（以氯苯那敏計）含有量RSD 分別為1.2%，1.0%、1.3%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 精密量取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得對乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、氯苯那敏峰面積RSD 分別為0.4%，0.6%、1.1%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的本品6 份（批號171113），每份約0.11 g，置于6 個25 mL 量瓶中；精密稱取對照品對乙酰氨基酚60.21 mg、鹽酸嗎啉胍60.02 mg，置同一10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置于上述25 mL 量瓶中；精密稱取馬來酸氯苯那敏對照品12.51 mg，置于50 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀釋至刻度，精密量 取1 mL，置于上 述25 mL 量瓶中，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 樣品含有量測定 精密稱取本品3 批，每批3 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量，結果見表3。

表3 各成分含有量測定結果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n＝3）

2.10 含有量均勻度測定 取本品3 批，每批10份，置于25 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）超聲助溶，放冷，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，各精密量取10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量。然后，根據2015年版《中國藥典》 四部方法［9］，計算A［標示量（100）與含有量平均值之差的絕對值］+2.2S（含有量標準差），結果見表4，發現均符合藥典規定［A+2.2S＜L（L以15.0 計）］。

表4 各成分含有量均勻度測定結果Tab.4 Results of content uniformity determination of various constituents

3 討論

3.1 檢測波長選擇 馬來酸氯苯那敏最大吸收波長為262 nm，但供試品溶液中其質量濃度較低，故考慮215 nm，同時在該處對乙酰氨基酚有波谷，鹽酸嗎啉胍有波峰。最終，確定215 nm 作為檢測波長［10］。

3.2 流動相選擇

3.2.1 離子對試劑種類與濃度 本實驗考察了戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉，發現離子對試劑烷基鏈越長，鹽酸嗎啉胍保留時間越長，與相鄰的對乙酰氨基酚色譜峰分離度越高［11-12］，而且其濃度對色譜峰保留也有很大影響［13］，故又對此進行考察。結果顯示，隨著離子對試劑濃度的升高，鹽酸嗎啉胍峰保留時間延長，峰型由不對稱逐漸優化為對稱，當辛烷磺酸鈉濃度高于0.005 mol/L 時，分離度合適，峰形良好。同時，考慮到離子對試劑濃度過大時對儀器和色譜柱均有不利影響，故最終選擇0.005 mol/L 辛烷磺酸鈉，可使鹽酸嗎啉胍在色譜柱上有較好的保留，并與其他成分的分離度理想，互不干擾。

3.2.2 緩沖液 本實驗考察了緩沖鹽對成分分析的影響，發現基線在無磷酸鹽的流動相中不平穩，峰形不對稱；添加磷酸二氫鉀后基線平穩，而且由于離子強度的改變，鹽酸嗎啉胍色譜峰保留時間提前，故選擇0.02 mol/L 磷酸二氫鉀作為緩沖液。

3.2.3 流動相pH 本實驗考察了2.0、3.0、4.0、4.5，發現隨著pH 降低鹽酸嗎啉胍保留時間延長，同時峰形高而尖銳，考慮到C18色譜柱對pH 值的耐受范圍為2～8，故最終選擇3.0 作為流動相pH。

3.3 柱溫選擇 柱溫對離子對色譜的影響較大［14］。本實驗考察了20、25、30、35、40 ℃，發現柱溫越高，各組分出峰越快，但過高時氯苯那敏色譜峰受干擾較大，峰形較差。最終，選擇30 ℃作為柱溫，此時出峰時間適中，峰形理想。