HPLC 法同時測定腸胃散中5 種成分

陳 鋒，楊海船，何春歡，李 嘉

（廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022）

腸胃散是由肉桂葉、吳茱萸、陳皮、艾葉、砂仁、丁香、茯苓、崗松、大葉桉9 味藥材組成的外用貼劑，具有溫中散寒、燥濕止瀉功效，用于寒濕蘊(yùn)結(jié)所致泄瀉、腹痛腸鳴，臨床輔助治療腹瀉療效顯著，安全性高［1］。

中藥復(fù)方雖然臨床效果確切，但其成分繁多復(fù)雜，對單味藥材或單一成分的質(zhì)量控制往往不具有代表性。中藥配伍有“君臣佐使”“七情合和”的概念，復(fù)方在應(yīng)用過程中常有增減調(diào)整，藥性發(fā)揮有眾多因素，量效關(guān)系成為其質(zhì)量優(yōu)劣的重要判定指標(biāo)，而有效成分組在一定程度上反映了中藥復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)［2-3］。

目前，尚無對腸胃散中成分含有量測定的研究，難以對其質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確客觀的評價。因此，本實(shí)驗(yàn)針對該方主要藥材肉桂葉、吳茱萸、陳皮等進(jìn)行考察，其性味相近，尤其在治療腸胃疾病中起到明顯的協(xié)同作用［4］。同時，桂皮醛、肉桂酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、橙皮苷是上述藥材指標(biāo)性成分，具有與功能主治相關(guān)的藥理活性［5-7］，故采用HPLC 法同時測定5 種成分的含有量，以期為腸胃散質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Waters e2695 系列四元梯度泵高效液相色譜儀，配置PDA 檢測器（美國Waters 公司）；XS205電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；B2200S 超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）。橙皮苷（110721-201818）、肉桂酸（110786-201604）、桂皮醛（110710-201720）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；吳茱萸堿（A0266）、吳茱萸次堿（A0267）對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司。腸胃散（批號 201812081、201812082、201812071、201812072、201812073、201812061、201812062、201812063、201812051、201812052）由廣西源安堂藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，20%A；10～60 min，20%～45% A，60～80 min，45% A）；體積流量1.0 mL/min；0～60 min 時在283 nm 波長下檢測橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛，60～80 min 時在215 nm波長下檢測吳茱萸堿、吳茱萸次堿；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于量瓶中，甲醇溶解后定容，即得（含橙皮苷112.90 μg/mL、肉桂酸 0.61 μg/mL、桂皮醛12.68 μg/mL、吳茱萸堿5.09 μg/mL、吳茱萸次堿6.45 μg/mL）。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取本品內(nèi)容物0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取（80 W、50 kHz）30 min，放冷至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，上清液過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按本品處方，分別制備不含陳皮、肉桂葉、吳茱萸的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離度符合要求，理論塔板數(shù)均大于9 000，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取各對照品適量，置于量瓶中，甲醇溶解定容，制成分別含橙皮苷451.60 μg/mL、肉桂酸2.444 μg/mL、桂皮醛50.70 μg/mL、吳茱萸堿20.36 μg/mL、吳茱萸次堿25.79 μg/mL 的對照品溶液，精密移取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積RSD 分別為0.20%、0.73%、0.30%、0.23%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（批號201812081）6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含有量RSD 分別為 0.59%、1.05%、1.45%、1.27%、1.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號201812081），室溫下 分別于0、4、8、12、16、24 h，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積RSD 分別為1.26%、1.03%、0.95%、1.14%、1.23%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取含有量已知的本品（批號201812081）約0.25 g，共6 份，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.11 樣品含有量測定 取本品10 批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g，n＝2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/g，n＝2）

3 討論

3.1 流動相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸洗脫時橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛峰形及分離度較乙腈-水均有所改善，而且對吳茱萸堿、吳茱萸次堿無影響，便于檢測，故選擇其作為流動相［8-10］。

3.2 檢測波長選擇 經(jīng)全波長掃描發(fā)現(xiàn)，橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛對照品溶液在283 nm 處均有較大吸收，與在各自最大吸收波長處測定的含有量差異不大，同時參考2015 年版《中國藥典》，確定其檢測波長為283 nm；根據(jù)文獻(xiàn)［11］報(bào)道，確定吳茱萸堿、吳茱萸次堿檢測波長為215 nm。

3.3 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（甲醇、75%甲醇、50%甲醇）和提取時間（20、30、40 min），發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑時，橙皮苷、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含有量明顯升高，而其他成分無明顯變化；超聲提取30、40 min 時各成分含有量變化不大，但均高于提取20 min 時。最終確定，最優(yōu)提取條件為甲醇超聲提取30 min。

4 結(jié)論

中藥成分復(fù)雜，藥效多樣，HPLC 是最常用的分析手段［12］，故本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時測定腸胃散中橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含有量，發(fā)現(xiàn)其簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。然而，該方法也有局限性，如腸胃散中含有丁香酚，它不僅有相關(guān)藥理活性，也在貼劑經(jīng)皮給藥過程中發(fā)揮著重要作用［13］，其含有量較高，但在復(fù)方中并無專屬性，不適合HPLC 分析。另外，腸胃散是透皮貼劑，含有多種揮發(fā)性成分，它們也是重要的藥效物質(zhì)，故相關(guān)研究對質(zhì)量控制、透皮規(guī)律、機(jī)制闡述都有參考價值［14］。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化、國際化對分析手段提出了更高的要求，多種評價體系被廣泛應(yīng)用，技術(shù)涵蓋色譜、光譜、生物、代謝等多個領(lǐng)域，質(zhì)量控制模式的多元化正成為發(fā)展方向［15］。本實(shí)驗(yàn)初步體現(xiàn)了這一點(diǎn)，今后也需要研究人員繼續(xù)加以探索。