HPLC 法同時(shí)測(cè)定十三味和中丸中9 種成分

徐 倩楊滿(mǎn)琴鮑學(xué)梅葛丹丹徐國(guó)兵胡云飛謝若男?

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031；4.亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800）

十三味和中丸是由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院研制的特色院內(nèi)制劑，由柴胡、枳殼、延胡索、炒白芍、陳皮、酒黃連、酒黃芩、川楝子、姜半夏、吳茱萸、茯苓、砂仁、甘草13 味藥材組成，具有疏肝理氣、和胃止痛之功效［1］，主要用于治療胃脘脹痛、嘈雜、噯氣等癥，臨床應(yīng)用二十多年，療效顯著。但該方藥味較多，組成復(fù)雜，單一成分分析很難全面反映其特征，而且不同成分吸收波長(zhǎng)也有很大差異，目前尚無(wú)完整的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系［2-3］。

多波長(zhǎng)HPLC 法測(cè)定復(fù)雜體系含有量已有很多相關(guān)報(bào)道［4-6］，目前主要依據(jù)復(fù)方中君臣佐使關(guān)系選擇君藥或臣藥，或成方中用量較大的藥材、特殊用藥作為考察指標(biāo)［7］，并依據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 一部選擇具體藥材的指標(biāo)成分。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定十三味和中丸中芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 的含有量，以期提供多指標(biāo)評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量的方法。

1 材料

1.1 儀器 U-3000 高效液相色譜儀（配置DAD檢測(cè)器）、FB15065 超聲波清洗器（美國(guó)Thermo 公司）；XPE-205 電子分析天平（0.001 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試劑與藥物 十三味和中丸（批號(hào)20170616、20170915、20171214、20180318、20180615，編號(hào)SSW1～SSW5，每10 丸重1.5 g）購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室。芍藥苷（批號(hào)110736-201640，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.20%）、延胡索乙素（批號(hào)110726-201011，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.90%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201212，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.70%）、柚皮苷（批號(hào)110722-201714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.30%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201316，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.30%）、黃芩苷（批號(hào)110715-201318，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.30%）、甘草酸 銨（批號(hào)110731-201418，質(zhì)量分 數(shù)93.10%）、柴胡皂苷a（批號(hào)110777-201309，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.00%）、柴胡皂苷d（批號(hào)110778-201409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.00%）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Tedia 公司；磷酸為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水［屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司］。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱(chēng)取本品干燥粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約0.50 g，置于50 mL 錐形瓶中，精密量取70%甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理40 min（250 W、50 kHz），放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 對(duì)照品適量，置于25 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，分別制成10.591、18.176、76.167、58.842、99.172、275.825、42.408、51.244、58.678 μg/mL 對(duì)照品溶液（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7）。

2.3 色譜條件 Waters SunfireTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210、230、283、345 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，混勻，得到系列質(zhì)量濃度溶液B1～B5，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，信噪比（S/N）≥10 為定量限，S/N≥3 為檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（B3）5.0 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面積RSD 分別為2.04%、1.81%、1.23%、0.91%、0.77%、0.56%、0.97%、1.63%、1.54%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（SSW1），分別于0、2、4、8、12、24 h，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面積RSD 分別為1.93%、1.69%、1.03%、0.89%、0.86%、0.41%、0.94%、1.53%、1.37%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（SSW1）粉末6 份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 峰面積RSD分別為0.97%、0.88%、0.71%、0.63%、0.66%、0.24%、0.61%、0.68%、0.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取含有量已知的本品（SSW1）粉末約0.50 g，精密加入適量對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)得芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d平均加樣回收率分別為100.1%、99.7%、99.3%、99.8%、100.4%、99.5%、95.1%、102.3%、97.7%，RSD 分別為 0.64%、1.89%、1.43%、0.74%、0.85%、1.76%、0.84%、0.48%、3.11%。

2.5 樣品含有量測(cè)定 取5 批本品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 中成藥組分較多，制備工藝復(fù)雜，使其質(zhì)量難以得到較好的控制［8-9］。十三味和中丸由四逆散、左金丸、金鈴子散、二陳湯四方相合，配伍黃芩、砂仁2 味藥材而成，以四逆散為疏肝理氣之母方，并以大量枳殼替代枳實(shí)，全方以枳殼為君藥，柴胡、炒白芍、姜半夏、陳皮、延胡索為臣藥［10］。前期曾考慮選擇母方中3 味藥材（柴胡、炒白芍、甘草）、君藥與臣藥（枳殼、柴胡、炒白芍、姜半夏、陳皮、延胡索）、額外配伍藥（酒黃芩、砂仁）作為研究對(duì)象，但砂仁有效成分大多為揮發(fā)性物質(zhì)，2015 年版《中國(guó)藥典》采用GC 法進(jìn)行定量測(cè)定，而半夏含有量在藥典中采用電位滴定法進(jìn)行測(cè)定，故未選擇兩者作為質(zhì)控指標(biāo)。結(jié)合處方用量（酒黃連用量較大），本實(shí)驗(yàn)最終選擇枳殼、柴胡、炒白芍、陳皮、延胡索、酒黃連、酒黃芩、甘草8 味藥材，并參考藥典方法對(duì)其特征性成分（如枳殼中柚皮苷、炒白芍中芍藥苷等）進(jìn)行分析。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3.2 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)以不同體積分?jǐn)?shù)甲醇、乙醇為溶劑，考察了超聲、回流、索氏提取及不同提取時(shí)間。綜合考慮方法穩(wěn)定性、便捷性、提取效率，最終選擇70%甲醇超聲處理40 min 作為供試品溶液提取方法。

3.3 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例甲醇/乙腈-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，最終選擇乙腈-0.2% 磷酸作為流動(dòng)相，此時(shí)色譜峰分離度、峰形良好。同時(shí)，將洗脫時(shí)間延長(zhǎng)到128 min，也為指紋圖譜（或特征圖譜）等后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 根據(jù)不同成分在紫外光下的吸收情況，本實(shí)驗(yàn)選擇最大吸收波長(zhǎng)（或其左右）以避免其他物質(zhì)干擾，保證測(cè)定準(zhǔn)確性。結(jié)合2015 年版《中國(guó)藥典》，最終確定各成分檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）、230 nm（芍藥苷、甘草酸）、283 nm（芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷）、345 nm（鹽酸小檗堿），此時(shí)色譜峰分離度、峰形理想，可用于定量分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定十三味和中丸中芍藥苷、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含有量，該方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考，并為今后特征圖譜、中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究［11-14］奠定了一定的理論基礎(chǔ)。