文冠果葉總黃酮微波輔助酶提取工藝的優化及其抗氧化、抑菌活性

王慧芳，趙飛燕，劉勇軍，趙潤柱，王 曼，姚 英，張恒慧

（1.太原工業學院化學與化工系，山西 太原 030008；2.渾源一中化學組，山西 大同 037400；3.太原工業學院環境與安全工程系，山西 太原 030008）

黃酮又稱黃堿素，是一種以2-苯基色原酮為基本結構的化合物，常在植物體內與糖結合成苷［1］，大多數植物都含有此類化合物，具有調節動物激素、防治心血管疾病、提高機體免疫力、促進機體健康等功效［2-3］，關于其抗氧化、抑菌活性的報道也很多［4-6］。課題組前期采用HP-20 型大孔樹脂對提取得到的陳皮黃酮進行分離提純后，測定它對3 種革蘭氏菌的抑制作用，發現對大腸桿菌的效果最佳［7］。

文冠果Xanthoceras sorbifoliaBunge 為無患子科文冠果屬木本落葉小喬木或灌木，原產于我國西北部，是一種食用油料樹種，壽命可超過200 年，具有很高的經濟價值［8-10］，其葉中也含有大量黃酮類化合物［11］。目前，對文冠果的研究主要集中在育苗、種植［12-13］、不同部位揮發油提取、理化性質、成分分析等方面［14-18］，而關于黃酮提取及其生物活性方面的報道相對較少。因此，本實驗進行微波輔助酶提取文冠果葉總黃酮，通過響應面法優化該成分提取工藝，并對其抗氧化、抑菌活性進行初步探索，旨在為油料作物多重開發提供理論依據。

1 材料

文冠果葉采自山東，經山西中醫藥大學中醫學院裴香萍副教授鑒定為正品。蘆丁對照品（純度＞98%）購自上海金穗生物科技有限公司；纖維素酶（活性1.5 萬U/g）購自上海如吉生物科技有限公司；茶多酚（純度＞98%）購自上海今品化學技術有限公司。DPPH·、ABTS·購自美國Sigma 公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。VIS-7220型光度計購自上海棱光科技有限公司；XH-10A 型微波儀購自北京祥鵠科技有限公司；DHP-9082 型恒溫培養箱購自上海雷韻實驗儀器有限公司；HB-10 型旋蒸儀購自德國IKA 公司；FA-2104 型數顯電子分析天平購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司。氫氧化鈉、氯化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、磷酸、濃鹽酸等均為分析純，購自天津化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 總黃酮提取 采用微波輔助酶法。將文冠果葉烘干、粉碎、過60 目篩后，稱取0.5 g 粉末于50 mL 圓底燒瓶中，加入3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH=4.5）和適量纖維素酶，55 ℃下水浴酶解60 min后沸水浴滅酶，冷卻10 min，加入適量乙醇室溫浸泡0.5 h，微波提取，2 000 r/min 離心10 min，取上層清液，洗滌后合并濾液，抽濾，濃縮，即得提取物。

2.2 總黃酮含有量測定

2.2.1 線性關系考察［19］以吸光度為縱坐標（A），溶液質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為A=8.517 0X+0.006 2（R2=0.999 2），在0～70 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.2 提取率測定 公式為提取率=（黃酮含有量/樣品粉末量）×100%。

2.2.3 重復性試驗［20］配制0.1 mg/mL 蘆丁對照品溶液，于0、2、4、6、8、10 h 測定吸光度，測得其RSD 為0.198%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 精密度試驗 取0.1 mg/L 蘆丁對照品溶液，連續測定吸光度6 次，測得其RSD 為0.346%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取0.050 6 mg/L 提取液10 mL，共9 份，置于50 mL 量瓶中，加入0.063 2、0.050 6、0.042 2 mg/L 蘆丁對照品溶液10 mL，共3 份，75%乙醇定容，測定吸光度，計算加樣回收率。結果，3 份溶液回收率分別為98.7%、99.5%、101.0%，RSD 為1.58%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 微波功率 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，乙醇體積分數60%，料液比1∶10，微波提取時間3 min，選擇微波功率400、500、600、700、800 W，按“2.1”項下方 法提取。

2.3.2 微波提取時間 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，乙醇體積分數60%，料液比1∶10，微波功率600 W，選擇微波時間1、3、5、7、9 min，按“2.1”項下方法提取。

2.3.3 料液比 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，乙醇體積分數60%，微波功率600 W，微波提取時間5 min，選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按“2.1”項下方法提取。

2.3.4 乙醇體積分數 固定樣品粉末用量0.5 g，纖維素酶用量0.15%，料液比1∶20，微波功率600 W，微波提取時間5 min，選擇乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%，按“2.1”項下方法提取。

2.3.5 纖維素酶用量 固定樣品粉末用量0.5 g，乙醇體積分數70%，料液比1∶20，微波功率600 W，微波提取時間5 min，選擇纖維素酶用量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，按“2.1”項下方法提取。

2.4 響應面法優化 在單因素試驗基礎上，選擇微波功率（A）、微波提取時間（B）、乙醇體積分數（C）作為影響因素進行試驗，因素水平見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 藥液配制 將最優條件下得到的提取液在50～55 ℃下濃縮至2.01 mg/mL，75%乙醇依次稀釋至5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/mL，并配制相同質量濃度維生素C、蘆丁溶液作為對照，冷藏備用。

2.5.2 對DPPH·的清除能力［20］公式為清除率=，其中Ai為樣品組（提取液+DPPH 溶液）吸光度，Aj為等體積無水乙醇代替DPPH 溶液的對照組吸光度，A0為等體積蒸留水代替提取液的空白組吸光度。

2.5.3 對ABTS·的清除能力（對文獻［20］稍作改動）精密稱取0.040 g ABTS 加入1.0 mg/mL K2S2O8溶液8.0 mL，密封避光反應16 h，置于250 mL 量瓶中，加入32 mL 去離子水，95% 乙醇定容，靜置10 h，作為ABTS 工作液。然后，精密吸取不同質量濃度提取液（或蘆丁、維生素溶液）各0.50 mL，加入0.80 mL ABTS 工作液，再加入2.70 mL 80%乙醇，反應6 min 后在734 nm 波長處測定吸光度，參比液為75%乙醇與無水乙醇（1∶1）混合液，按“2.5.2”項下公式計算。

2.6 抑菌活性測定

2.6.1 被測菌種擴培 參考文獻［21］方法進行操作。

2.6.2 抑菌實驗 將提取液按“2.5.1”項下方法濃縮后，室溫下晾干冷藏。50%乙醇配制總黃酮粗提物、茶多酚供試液，藥液質量濃度分別為8.56、4.28、2.14 mg/mL。濾紙片法［22］測定粗提物、茶多酚抑菌活性，方法為將培養基在37 ℃恒溫箱中保溫48 h 后，測定抑菌圈直徑（十字交叉測2 次，取平均值），公式為抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-濾紙片直徑。

3 結果

3.1 單因素試驗

3.1.1 微波功率［23］圖1 顯示，總黃酮提取率隨著微波功率升高而先增后減，其原因是微波離子傳導作用可隨其功率增大而加強，促使文冠果葉細胞膜膨化、破裂，總黃酮，于功率為600 W 時全部溶出；繼續增大微波功率時，不但損耗能量，而且過剩的熱效應會促使總黃酮分解［24］，故確定微波功率為600 W。

圖1 微波功率對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of total flavonoids

3.1.2 微波提取時間 圖2 顯示，當微波提取時間小于5 min時，總黃酮提取率隨著時間延長熱效應逐漸加強，釋放量隨之增大，在5 min 時最高，表明該成分已完全釋放；在7 min 時，提取率略有下降；在9 min 時，提取率迅速下降，主要是由于過量熱效應可使總黃酮分解，故確定微波時間為5 min。

圖2 微波提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the extraction rate of total flavonoids

3.1.3 料液比 圖3 顯示，隨著料液比中乙醇用量增加，總黃酮逐漸被溶出，提取率逐漸增加；但其過量時，反而會因雜質溶出而導致總黃酮提取率下降，故確定料液比為1∶20。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

3.1.4 乙醇體積分數 圖4 顯示，當乙醇體積分數小于70%時，總黃酮提取率隨著其升高而增加，并在70% 時達到溶解平衡，提取率最高；大于70%時，過量滲透壓會將文冠果葉中雜質溶出，導致提取率反而下降，故確定乙醇體積分數為70%。

圖4 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

3.1.5 纖維素酶用量［25］圖5 顯示，當纖維素酶用量在0.05%～0.20%之間時，隨著文冠果葉細胞壁被逐漸破壞，總黃酮被逐漸釋放出，其提取率也隨之增加；在0.20%～0.25%之間時，提取率卻在下降，這是因為過度破壞細胞壁會增加雜質溶出，故確定纖維素酶用量為0.20%。

3.2 響應面法優化 通過Design-Expert 8.0.5 軟件，以總黃酮提取率為評價指標（Y）進行優化，結果見表2，回歸方程為Y=9.86-0.14A+0.46B-0.065C-0.167AB+0.34AC-0.063BC-0.21A2-0.28B2-0.21C2。

圖5 纖維素酶用量對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of cellulase consumption on the extraction rate of total flavonoids

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型顯著；失擬項P＞0.05，表明模型失擬性不顯著；R2為0.999 6，表明模型回歸顯著，準確度高；為0.999 0，表明總黃酮提取率與各因素之間相關度較高；CV 僅為0.72%，表明模型可靠性高；模型F值與變量對響應值影響呈正比［26］，故各因素影響程度依次為微波提取時間（B）＞微波功率（A）＞乙醇體積分數（C），與單因素試驗結果一致；兩因素相互作用影響程度依次為AC＞BC＞AB。響應面分析見圖6。

3.3 驗證試驗 最優工藝為纖維素酶用量0.20%，乙醇體積分數70.10%，料液比1∶20，微波功率597.19 W，提取時間6.49 min，總黃酮提取率為9.92%，結合實際生產操作，將其修正為微波功率600 W，提取時間6 min，乙醇體積分數70%，其他條件不變。然后，進行3 批驗證試驗，測得總黃酮平均提取率為9.90%，接近預測值9.92%，表明模型擬合情況良好。

圖6 各因素響應面圖Fig.6 Response surface plots for various factors

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

3.4 抗氧化活性

3.4.1 對DPPH·的清除能力 圖7顯示，各樣品對DPPH·的清除能力依次為維生素C＞總黃酮＞蘆丁，并均在被測質量濃度范圍內呈良好的線性關系，R2在0.959 6～0.982 2 之間，IC50分別為3.82、12.23、49.36 μg/mL，其中維生素C、總黃酮清除能力均隨著其質量濃度升高而增強，而蘆丁受其影響相對較小。另外，總黃酮質量濃度為15.00 μg/mL時清除能力較小，可能是由于實驗誤差所致，需作進一步研究。

圖7 各樣品對DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging abilities of various samples on DPPH·

3.4.2 對ABTS·的清除能力 圖8顯示，各樣品隨著其質量濃度升高對ABTS·的清除能力也隨之加強，其中總黃酮在低質量濃度下與維生素C 差距較大，而與蘆丁接近，但進一步升高時逐漸接近維生素C，同時三者均在被測質量濃度范圍內呈良好的線性關系，R2在0.972 0～0.984 8 之間，IC50分別為1.59、14.59、42.90 μg/mL。與DPPH·比較，總黃酮對ABTS·的清除能力相對較弱，質量濃度均為25.00 μg/mL 時低了2.60%。

圖8 各樣品對ABTS·的清除能力Fig.8 Scavenging abilities of various samples on ABTS·

3.5 抑菌活性 表4 顯示，總黃酮、茶多酚對3種革蘭氏菌的抑制作用隨著其質量濃度升高而加強，程度依次為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌，其中總黃酮質量濃度為8.56、4.28、2.14 mg/mL 時抑菌圈直徑分別比茶多酚大了1.12、0.38、0.06 mm，比95% 乙醇大了0.42、1.04、0.80 mm；對金黃色葡萄球菌的抑制作用相對較弱，僅其質量濃度為8.56 mg/mL 時抑菌圈直徑比茶多酚大0.30 mm，但整體上仍比95% 乙醇強；在質量濃度8.56 mg/mL 下對枯草芽孢桿菌的抑制作用比茶多酚強，而在8.56、4.28 mg/mL 下強于95%乙醇。

表4 各樣品抑菌活性測定結果（）Tab.4 Results of bacteriostasis activity determination of various samples（）

表4 各樣品抑菌活性測定結果（）Tab.4 Results of bacteriostasis activity determination of various samples（）

4 結論

本實驗所得最優文冠果葉總黃酮微波輔助酶提取工藝為磷酸緩沖液（pH=4.5）3 mL，纖維素酶用量0.20%，乙醇體積分數70%，料液比1∶20，微波功率600 W，提取時間6 min，總黃酮提取率為9.90%，接近于預測值，表明工藝準確可靠，比郝倩［11］等報道的超聲法提高了2.44 倍。總黃酮提取液對DPPH·、ABTS·均有較強的清除能力，對前者作用更強，雖然略低于維生素C，但明顯高于蘆丁；對3 種革蘭氏菌均有較強的抑制作用，程度依次為大腸桿菌＞金黃色葡萄球桿菌＞枯草芽孢桿菌，并且對大腸桿菌的抑菌活性明顯強于茶多酚，而對后兩者則相對較弱。

綜上所述，文冠果葉總黃酮不但具有較強的抗氧化能力，還有著良好的抑菌活性（尤其是對大腸桿菌），表明該植物可作為天然抗氧化劑和抑菌劑應用于食品、保健品等行業，開發前景廣闊。