P16和Ki-67在宮頸低級別鱗狀上皮內病變中的表達及與預后的關系

馬新義 ，許 勵，王桂花

(1.杭州迪安醫學檢驗中心 病理實驗室, 浙江 杭州 310030; 2. 杭州師范大學附屬醫院 病理科, 浙江 杭州 310015)

2018年全球約有57萬新發宮頸癌病例和31.1萬死亡宮頸癌病例，其發病率和死亡率均居所有女性惡性腫瘤的第4位[1]。我國每年的宮頸癌新發病例占世界總新發病例的20%～30%，且以每年2%～3%的速度遞增，并呈年輕化的趨勢[2]。WHO女性生殖系統分類將宮頸癌前病變命名為宮頸上皮內瘤變，并分為低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial leisons/cervical intraepithelial neoplasm grade 1, LSIL/CIN1)和高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)。根據美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)宮頸癌篩查指南，LSIL的治療以臨床觀察為主，密切隨訪，HSIL需要宮頸局部治療。但LSIL中隱含著HSIL的風險，尋找有效的早期預測因子對提示LSIL的轉歸和對初次確診為LSIL的患者進行分流干預具有積極意義。本研究探討P16和Ki-67在LSIL/CIN1中的表達情況及與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年8月—2018年10月因可疑宮頸病變在杭州迪安醫學檢驗中心行陰道鏡下宮頸活檢，經組織學病理診斷為宮頸LSIL/CIN1的84例患者為研究對象。所選LSIL/CIN1患者年齡27～69歲，平均(44.7±9.1)歲。另選取同期經組織學病理診斷為非腫瘤性正常宮頸組織22例，年齡22～65歲，平均(43.0±5.7)歲。本研究經杭州迪安醫學檢驗中心倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 組織標本經中性甲醛固定、常規石蠟包埋、4 μm連續切片后經二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，常規蘇木素-伊紅(hematoxylon-eosin，HE)染色，免疫組化實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用Ventana 全自動免疫組化染色儀(瑞士羅氏公司)檢測P16的表達情況，采用EnVision二步法進行免疫組化檢測Ki-67的表達情況， Ki-67單克隆抗體(克隆號：7B11)購于北京中杉金橋生物有限公司；P16單克隆抗體(克隆號：E6H4)購于上海羅氏有限公司。P16陽性定位于細胞核或細胞漿內，胞漿及細胞核出現棕黃色顆粒判讀為陽性細胞，散在或者無棕色顆粒染色判讀為陰性細胞[3]。Ki-67陽性定位于細胞核，以細胞核出現棕黃色或棕色顆粒判定為陽性細胞。陽性細胞表達率：陽性細胞率0%～<5%為陰性(-)，5%～<25 %為弱陽性(+)，25 %～<50 %為陽性(++)，≥50 %為強陽性(+++)。免疫組化結果由2位資深婦科專科病理醫師采用雙盲法閱片判讀。

1.3 預后判讀 每位隨訪病例均經巴氏涂片檢查、陰道鏡活檢和HR-HPV檢測。疾病進展：組織學診斷結果為HSIL/CIN2及以上級別病變；消退：標本組織學診斷結果為陰性；病變持續：宮頸活檢或宮頸細胞學結果為LSIL/CIN1[4]。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計軟件，計數資料采用Fisher精確檢驗或卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P16和Ki-67的表達情況 LSIL/CIN1病例標本中P16陽性表達率為28.6%(24/84)，正常/炎癥病例中P16未見表達，差異具有統計學意義(χ2=46.124，P<0.001)。Ki-67在LSIL/CIN1病例標本中的陽性表達率(52.4%，44/84)高于在宮頸正常/炎癥組中的陽性表達率(22.7%，5/22)，差異具有統計學意義(χ2=8.792，P=0.003)。LSIL/CIN1組Ki-67陽性細胞表達率(5%～<25%)的比例為42.9%(36/84), 陽性細胞表達率(25%～<50%)的比例為9.5%(8/84)；宮頸正常/炎癥組Ki-67陽性細胞表達率(5%～<25%)的比例為22.7%(5/22)，未見陽性細胞表達率(25%～<50%)的病例。見封三圖1、圖2。

2.2 P16和Ki-67表達與LSIL/CIN1預后的關系 隨訪12個月，復查結果顯示，84例LSIL/CIN1病例中有47例病變消退，24例持續，13例進展。LSIL/CIN1進展組病例中P16陽性表達率(76.9%，10/13)高于持續組(25.0%，6/24)和消退組(19.1%，9/47)，差異均具有統計學意義(P<0.05)；LSIL/CIN1進展組Ki-67陽性表達率(100.0%，13/13)高于持續組(54.2%，13/24)和消退組(38.3%，18/47)，差異均有統計學意義(P<0.05)。Ki-67陽性細胞表達率(25%～<50%)的病例中，進展組比例(38.5%，5/13)高于持續組(8.3%，2/24)和消退組(2.1%，1/47)，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 P16和Ki-67表達與LSIL/CIN1預后的關系

3 討論

HPV感染尤其是HR-HPV持續感染是誘發宮頸鱗狀上皮內病變及宮頸癌的主要危險因素和必要條件之一[5-7]。P16是高危型HPV感染存在的標志[8]，也是HPV具有轉錄活性即具有真正致瘤作用的標志。P16阻止細胞從G1期到S期，負性調控細胞增殖及分裂，具有抑癌作用[9]。人感染高危型HPV后，高危型HPV DNA整合進入宿主細胞基因組導致E6和E7病毒基因表達，E6降解P53，E7結合pRb并使其失活，致使pRb喪失對p16基因的負反饋抑制作用，導致P16蛋白呈現過表達[10]。有文獻報道[11]，98%以上的高危型HPV感染顯示P16呈彌漫陽性，P16甚至可以作為高危型HPV檢測的代替物，其敏感性和特異性達80%。在低級別宮頸上皮內瘤變中，P16染色陰性存在較高的倒退傾向，染色陽性的更傾向于發展至高級別病變[12]，P16不僅在宮頸上皮內瘤變的分級診斷中具有重要臨床意義，還在宮頸癌前病變進展的風險評估中具有應用價值。本研究結果顯示，LSIL/CIN1病例標本中P16陽性表達率明顯高于正常/炎癥病例中的表達，這與Zhang等[13]的報道結果相一致，提示P16在良性或反應性改變與高危型HPV感染相關的宮頸前驅病變之間的鑒別診斷中具有一定意義，P16陽性支持其為HPV感染性鱗狀上皮內病變，但是陰性并不能排除LSIL。劉苗[14]的研究顯示，P16的表達率會隨著宮頸鱗狀病變級別升高而呈上升趨勢，在正常細胞周期中P16不表達；但當細胞周期調控機制受損時，P16增殖活躍；隨著宮頸病變級別的增高，P16呈現高表達。本研究病例隨訪結果顯示，LSIL/CIN1進展組病例中P16陽性表達率明顯高于維持組和消退組；提示P16在預測CIN1病人預后進展中具有一定應用價值。但Herfs等[15]報道指出，P16在非鱗狀上皮內病變中可能出現假陽性，單獨應用P16標記尚不能作為宮頸上皮內瘤病變的診斷依據，需聯合其他標記物才可以進行確定診斷。

細胞分裂、增殖的異常活躍是腫瘤惡變的重要環節。Ki-67是一種重要的反映腫瘤增殖活性的蛋白，與增殖細胞核抗原(PCNA)相結合的單抗，標記細胞核及染色體處于G1、S、G2和M期，以此確定腫瘤生長率，Ki-67與腫瘤的增殖、浸潤、轉移潛能密切相關[16]。近年來，有關Ki-67表達與婦科腫瘤發生、發展及預后的關系成為研究熱點。Marko等[17]發現Ki-67在HR-HPV感染的宮頸上皮中高表達，Ki-67的陽性指數隨CIN級別的升高逐漸增加。本研究結果顯示，Ki-67在LSIL/CIN1病例標本中的陽性表達率明顯高于在宮頸正常/炎癥病例中的陽性表達率，說明在宮頸低級別CIN組織中存在異常分裂、增殖；LSIL/CIN1進展組Ki-67陽性表達率明顯高于持續組和消退組，提示Ki-67的表達陽性可以預測CIN1病人預后進展；Ki-67陽性細胞表達率(25%～<50%)的病例中，進展組陽性表達率明顯高于持續組和消退組，說明Ki-67表達越高，進展的風險越高，這與王曉平等[18]的報道結果相似。

綜上所述，P16和Ki-67的陽性表達有助于鑒別宮頸低級別鱗狀上皮內病變與宮頸炎癥性病變和預測宮頸低級別鱗狀上皮內病變的預后結果。