不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜扦插苗生理特性和硒吸收的影響

黃科文，李克強(qiáng)，歲立云，劉 繼，劉 磊，王 鋌，鄭陽霞，林立金，廖明安

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130； 2. 成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都 611130；3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，成都 611130)

硒(Selenium，Se)是動植物不可或缺的必需元素[1]，增強(qiáng)經(jīng)濟(jì)作物對土壤硒的富集能力既能促進(jìn)硒在生物圈的循環(huán)，還能提高食物鏈中的硒含量，進(jìn)而降低人體硒攝入不足的風(fēng)險。目前，土壤施硒或噴施硒肥是提高經(jīng)濟(jì)作物硒含量的主要措施，盡管在果樹、蔬菜、茶葉及農(nóng)作物等產(chǎn)業(yè)中取得了突出成果[2]，但Thiry等[3]指出大部分植物均為非聚硒類植物，不僅對硒的富集能力有限，在較高濃度的硒處理下還會出現(xiàn)植株徒長，蛋白質(zhì)降解，葉片萎縮等癥狀，無法正常生長[4-5]。因此，借助適宜的農(nóng)業(yè)措施或栽培技術(shù)來提高經(jīng)濟(jì)作物的抗逆性和富硒能力具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。嫁接是將砧木與接穗相互拼接，使其切口的相鄰細(xì)胞分化形成同型組織，進(jìn)而共同發(fā)育成完整植株的無性繁殖手段，被廣泛應(yīng)用于園藝植物的栽培及繁育中[6-7]。嫁接不僅可以保持母本的優(yōu)良性狀，還在增強(qiáng)植株的抗病[8]、抗旱[9]、耐鹽[10]和耐熱[11]等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，砧穗的接口在經(jīng)歷了愈傷組織發(fā)生、胞間連絲形成、形成層的分化與連接、木質(zhì)部及維管束連接之后，砧木與接穗通過木質(zhì)部與韌皮部開始進(jìn)行水分、營養(yǎng)以及信號物質(zhì)的運(yùn)輸與傳遞[12]。長久以來，傳統(tǒng)的理論認(rèn)為不同砧木對土壤中礦質(zhì)元素吸收特性的差異是影響接穗營養(yǎng)物質(zhì)含量的關(guān)鍵因素[13-14]。王曉芳等[15]認(rèn)為，造成葡萄不同砧穗組合N、P、K水平差異的主要原因是不同砧木的根系在形態(tài)及結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，進(jìn)而影響了接穗對大量元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。曹耀鵬等[16]的觀點(diǎn)與其相似，認(rèn)為土壤中營養(yǎng)元素的垂直分布及砧木根系的形態(tài)特征是導(dǎo)致植株對土壤元素的吸收表現(xiàn)出時效性差異的主要因素。但隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)砧木與接穗之間存在著蛋白質(zhì)及RNA等遺傳物質(zhì)的長距離運(yùn)輸，為揭示嫁接對植株遺傳性狀的影響開啟了新的篇章[17-18]。此外，利用不同種類的植株嫁接還可能影響甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，導(dǎo)致砧木與接穗的表觀遺傳發(fā)生一定頻率的變化[19]。林立金[20]以不同長勢的少花龍葵為嫁接材料，發(fā)現(xiàn)即便是自根嫁接也能提高植株的DNA甲基化水平，并穩(wěn)定地遺傳到F1代。這些研究證明，在嫁接條件下砧木與接穗之間發(fā)生著復(fù)雜的砧穗互作效應(yīng)，而這種互作效應(yīng)是否可以影響植株對硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)？又能否隨著嫁接次數(shù)的增加產(chǎn)生疊加效應(yīng)？以上問題的揭示不僅可以為嫁接技術(shù)的理論研究提供新的思路，還對增強(qiáng)植物富硒能力的繁育方法具有指導(dǎo)意義。扦插是利用植物的細(xì)胞全能性，使其離體器官在適宜的環(huán)境條件下再生成完整植株的繁殖技術(shù)，具有完整繼承親本遺傳物質(zhì)，保持品種優(yōu)良特性等優(yōu)點(diǎn)[21]。以接穗的莖段扦插繁殖既能保持親本的遺傳性狀又能通過不定根吸收土壤養(yǎng)分，可以有效避免砧木異源根的影響，客觀真實(shí)地反映砧穗互作效應(yīng)對植株生長發(fā)育的影響。

豆瓣菜(Nasturtiumofficinale)為十字花科豆瓣菜屬水生草本植物，具有分布廣、長勢旺及扦插成活率高等優(yōu)點(diǎn)，因其口感脆嫩，營養(yǎng)豐富，常用作綠葉蔬菜食用[22]。研究表明豆瓣菜是一種次生富硒植物，對外源硒的耐受范圍廣，富集能力強(qiáng)，當(dāng)土壤硒含量達(dá)到10 mg/kg時，既能顯著提高豆瓣菜各部位硒含量，還能有效促進(jìn)其生長[23]。筆者前期研究了不同砧穗組合對豆瓣菜扦插苗硒積累的影響，發(fā)現(xiàn)以西蘭花(十字花科)為砧木嫁接豆瓣菜后扦插對豆瓣菜扦插苗的生長及抗逆性均有顯著的促進(jìn)作用。鑒于此，本試驗(yàn)在土壤硒含量為10 mg/kg條件下，以西蘭花為砧木，研究不同次數(shù)嫁接后扦插對豆瓣菜生長及富硒特性的影響，以期進(jìn)一步促進(jìn)豆瓣菜對硒的積累并為揭示砧穗互作效應(yīng)的生理機(jī)制提供 參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試豆瓣菜嫩枝取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)周圍農(nóng)田，西蘭花為早熟耐熱品種‘綠洲西蘭花’。

供試土壤為水稻土，取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)周圍農(nóng)田(30°71′N，103°86′E)，本底值為pH 7.42，有機(jī)質(zhì)31.73 g/kg，全氮1.05 g/kg，全磷0.37 g/kg，全鉀25.71 g/kg，堿解氮56.13 mg/kg，速效磷17.15 mg/kg，速效鉀56.65 mg/kg，全硒0.35 mg/kg。將土壤風(fēng)干、碾碎，稱取4.0 kg裝于21 cm×20 cm(高×直徑)的塑料盆內(nèi)，加入分析純Na2SeO3溶液，使土壤硒含量為10 mg/kg，保持土壤田間持水量的80%，自然放置平衡4周，期間不定期翻土混合，使土壤充分混合均勻。

1.2 試驗(yàn)方法

2017年9月，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)避雨棚內(nèi)將豆瓣菜嫩枝扦插于持淹水狀態(tài)的土壤(未添加硒)中繁育，扦插深度為土壤以下2 cm，栽培期間及時澆水并預(yù)防病蟲害，每2周澆灌1次 N∶P∶K=15∶15∶15(體積比)的復(fù)合肥水溶液。西蘭花種子于2017年9-12月每2周進(jìn)行1次穴盤育苗以確保每次嫁接均有長勢一致的砧木，待幼苗莖高約8～9 cm，5～6片真葉展開時移栽至21 cm×20 cm(高×直徑)的塑料盆內(nèi)中栽培(未添加硒土壤)，適應(yīng)1周后進(jìn)行嫁接處理。

嫁接處理分3個階段，第1階段：將西蘭花幼苗從離地約4 cm處剪斷，保留砧木3片真片，取2 cm長的豆瓣菜莖尖為接穗進(jìn)行嫁接處理。嫁接采用劈接法，接口處用1 cm寬的嫁接帶捆綁固定，并用透明塑料袋罩住整株植株防風(fēng)保濕，待嫁接苗成活后去掉嫁接帶及塑料袋。第2階段：在第1階段嫁接苗成活30 d后，分別以未嫁接及一次嫁接的豆瓣菜莖尖為接穗，新培育出的西蘭花幼苗為砧木進(jìn)行嫁接處理，方法同上。第3階段：在第2階段嫁接苗成活30 d后，分別以未嫁接、一次嫁接、二次嫁接的豆瓣菜莖尖為接穗，新培育出的西蘭花幼苗為砧木進(jìn)行嫁接處理，方法同上。

扦插試驗(yàn)于2018年1月在溫度為25 ℃，光照度為4 000 lx的溫室內(nèi)進(jìn)行。待第3階段嫁接苗成活30 d后，取未嫁接(對照)、一次嫁接、二次嫁接、三次嫁接的長勢一致，長約5 cm的豆瓣菜嫩枝扦插于準(zhǔn)備好的硒處理土壤中，每盆扦插3株，每個處理重復(fù)6次。栽培期間及時澆水保持土壤持淹水狀態(tài)，不定期更換盆與盆的位置以減弱邊際效應(yīng)的影響，及時去除雜草并防治病蟲害，60 d后收獲材料。

1.3 樣品收集與測定分析

2018年3月，收集豆瓣菜自上往下第3～4片功能葉，采用乙醇-丙酮提取法[24]測量豆瓣菜葉片的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量，剩余葉片經(jīng)磷酸緩沖液研磨、離心、提取后分別采用氮藍(lán)四唑法[25]、愈創(chuàng)木酚法[25]、高錳酸鉀滴定法[25]以及考馬斯亮藍(lán)染色法[25]測量豆瓣菜葉片的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性以及可溶性蛋白含量。之后整株收獲豆瓣菜并分裝成根、莖、葉，經(jīng)自來水沖洗干凈后用去離子水潤洗3次，在110 ℃殺青15 min，80 ℃條件下烘干至衡量，分別用電子天平稱量。烘干樣品經(jīng)粉碎，過篩后分別采用蒽酮比色法[25]及氫化物原子熒光光譜法[24]測定豆瓣菜根、莖、葉的可溶性糖及硒含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS進(jìn)行方差分析(Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較)，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植物地上部分硒含量/根系硒含量，硒積累量=植物硒含量×植物生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜扦插苗生物量的影響

由表1可知，以西蘭花為砧木進(jìn)行不同次數(shù)嫁接后，豆瓣菜扦插苗各部位的生物量均隨著嫁接次數(shù)的增加呈上升趨勢，說明多次嫁接對豆瓣菜扦插苗干物質(zhì)的積累具有一定積累效應(yīng)。在所有嫁接處理中，三次嫁接使豆瓣菜扦插苗根系、莖稈、葉片以及地上部分的生物量均顯著高于其他處理，分別較對照提高266.84%、256.49%、 174.03%、211.01%。另外，二次嫁接使豆瓣菜扦插苗各部位的生物量較一次嫁接提高99.87%～ 209.39%，而與二次嫁接相比，三次嫁接則使其生物量提高11.27%～16.35%。對豆瓣菜扦插苗的根冠比而言，二次嫁接和三次嫁接顯著提高豆瓣菜扦插苗的根冠比，而一次嫁接則使其顯著低于對照，這可能與豆瓣菜扦插苗的可溶性糖含量在不同次數(shù)嫁接處理下存在差異有關(guān)，將在討論部分詳細(xì)論述。

2.2 不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜扦插苗光合色素含量的影響

由表2可知，與生物量結(jié)果相似，豆瓣菜扦插苗的葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量均隨著嫁接次數(shù)的增加呈上升趨勢，并在三次嫁接處理下達(dá)到最大值，較對照提高43.49%～ 65.82%。與對照相比，一次嫁接、二次嫁接以及三次嫁接使豆瓣菜扦插苗總?cè)~綠素的含量分別較對照提高了28.96%、48.93%和59.48%，類胡蘿卜素含量分別較對照提高 21.11%、37.62%和 43.49%。二次嫁接使豆瓣菜扦插苗的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別較一次嫁接提高14.91%、17.41%、13.63%，而與二次嫁接相比，三次嫁接則分別使其提高6.56%、8.80%和 4.27%。與葉綠素含量的趨勢相反，豆瓣菜扦插苗的葉綠素a/b隨著嫁接次數(shù)的增加表現(xiàn)出下降的趨勢，這有利于豆瓣菜在弱光環(huán)境(溫室)下對光能的利用，增強(qiáng)葉片的凈光合速率。

表1 不同次數(shù)嫁接處理下豆瓣菜扦插苗生物量Table 1 Biomass of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

注：數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:The data are “mean ± standard deviation”, and the different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同次數(shù)嫁接處理下豆瓣菜扦插苗光合色素含量Table 2 Photosynthetic pigment content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

2.3 不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜扦插苗抗氧化酶活性和MDA含量的影響

由表3可知，豆瓣菜扦插苗的SOD活性和POD活性隨著嫁接次數(shù)的增加均表現(xiàn)出下降的趨勢，并在三次嫁接處理下達(dá)到最小，分別較對照降低20.87%和32.73%。就豆瓣菜扦插苗的CAT而言，隨著嫁接次數(shù)的增加豆瓣菜扦插苗的CAT活性表現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢，并在三次嫁接處理下達(dá)到最大值，較對照提高54.92%。另外，豆瓣菜扦插苗的MDA含量隨嫁接次數(shù)的增加表現(xiàn)出下降的趨勢，一次嫁接、二次嫁接和三次嫁接分別使其MDA含量較對照降低了14.50%、 38.62%、43.05%。這表明嫁接增強(qiáng)了豆瓣菜扦插苗對氧化脅迫的抗逆性，且這種促進(jìn)作用隨嫁接次數(shù)的增加得到進(jìn)一步加強(qiáng)。

表3 不同次數(shù)嫁接處理下豆瓣菜扦插苗抗氧化酶活性和MDA含量Table 3 Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

2.4 不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜扦插苗可溶性糖含量的影響

由表4可知，對豆瓣菜扦插苗的可溶性糖而言，與對照相比，一次嫁接不同程度地降低了豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的可溶性糖含量，而二、三次嫁接使其顯著高于對照。在所有處理中，三次嫁接使豆瓣菜扦插苗根系、根莖、葉片以及地上部分的可溶性糖含量均顯著高于其他處理，并分別較對照提高81.33%、71.28%、42.02%和 81.36%。另外，隨著嫁接次數(shù)的增加，豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的可溶性糖含量表現(xiàn)出上升趨勢，說明多次嫁接有利于豆瓣菜扦插苗可溶性糖的積累，在降低豆瓣菜細(xì)胞水勢，增強(qiáng)植株抗逆性中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。

表4 不同次數(shù)嫁接處理下豆瓣菜扦插苗可溶性糖含量Table 4 Soluble sugar content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting g/g

2.5 不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜扦插苗硒含量的 影響

由表5可知，與對照相比，一次嫁接、二次嫁接以及三次嫁接均顯著提高了豆瓣菜扦插苗根系的硒含量，分別較對照提高7.05%、6.84%和 6.47%。而豆瓣菜扦插苗莖稈、葉片以及地上部分的硒含量均隨著嫁接次數(shù)的增加呈下降趨勢，其中三次嫁接使豆瓣菜扦插苗莖稈、葉片以及地上部分的硒含量均達(dá)到最低，分別較對照降低40.07%、24.22%和32.50%。另外，不同次數(shù)嫁接處理均顯著降低了豆瓣菜扦插苗的硒轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，并隨著嫁接次數(shù)的增加表現(xiàn)出下降的趨勢。

表5 不同次數(shù)嫁接處理下豆瓣菜扦插苗硒含量Table 5 Selenium content of N.officinale cuttings under different numbers of grafting

2.6 不同次數(shù)嫁接對單株豆瓣菜硒積累量的影響

由表6可知，豆瓣菜扦插苗不同部位的硒積累量均隨著嫁接次數(shù)的增加呈上升趨勢，其中二次嫁接及三次嫁接使其根系、根莖、葉片以及地上部分的硒積累量均顯著高于對照，而與對照相比，一次嫁接對豆瓣菜扦插苗硒積累量的影響不顯著。在所有處理中，三次嫁接使豆瓣菜扦插苗根系、莖稈、葉片以及地上部分的硒積累量均達(dá)到最大，分別較對照提高290.44%、113.92%、 107.94%和110.08%。

表6 不同次數(shù)嫁接處理下單株豆瓣菜扦插苗硒積累量Table 6 Selenium accumulation of single N.officinale cutting under different numbers of grafting μg

3 討 論

嫁接能夠影響植株的多種農(nóng)藝性狀，選擇適宜的砧穗組合嫁接是增強(qiáng)作物抗逆性，改善果實(shí)品質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的重要途經(jīng)之一。在本研究中，以西蘭花為砧木嫁接對豆瓣菜扦插苗的生長及抗逆性存在不同程度的影響。隨著嫁接次數(shù)的增加，豆瓣菜扦插苗各部位的生物量和光合色素含量均表現(xiàn)出上升的趨勢，這暗示多次嫁接對豆瓣菜扦插苗部分性狀的影響可能存在疊加效應(yīng)，與管雪松等[26]的研究結(jié)果相似。對豆瓣菜扦插苗的生物量而言，二次嫁接使豆瓣菜扦插苗各部位的生物量較一次嫁接提高99.87%～ 209.39%；而與二次嫁接相比，三次嫁接則使其生物量提高11.27%～16.35%。說明多次嫁接雖然對豆瓣菜扦插苗生長的促進(jìn)效果具有疊加作用，但這種效應(yīng)隨著嫁接次數(shù)的增加呈下降的趨勢，與嫁接對豆瓣菜扦插苗光合色素含量的影響相似。光合色素是植物光合作用的重要基礎(chǔ)，其含量與植物的光合作用效率呈顯著正相關(guān)，而在弱光條件下，由于葉綠素b具有更強(qiáng)的短波利用率，導(dǎo)致植株葉綠素a/b值越低對光能的利用率越高[27]。本研究結(jié)果表明，隨著嫁接次數(shù)的增加，豆瓣菜扦插苗的光合色素含量及葉綠素a/b分別呈上升及下降的趨勢，有利于豆瓣菜扦插苗在弱光條件下(溫室)的光合作用，可能是嫁接促進(jìn)豆瓣菜扦插苗干物質(zhì)積累的重要原因之一。對豆瓣菜扦插苗的根冠比而言，二、三次嫁接顯著提高了豆瓣菜扦插苗的根冠比，而一次嫁接則使其顯著低于對照，這也許與豆瓣菜扦插苗的可溶性糖含量在不同次數(shù)嫁接處理下存在差異有關(guān)。可溶性糖不僅是同化產(chǎn)物及能量的貯藏形式，在調(diào)控植物細(xì)胞滲透式，同化物分配以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中均發(fā)揮著重要作用[28]。本研究表明，一次嫁接不同程度降低豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的可溶性糖含量，而二、三次嫁接對其則表現(xiàn)出顯著的提升作用。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是因?yàn)槎啻渭藿犹岣叨拱瓴藢藿用{迫的適應(yīng)性，加速愈傷組織的發(fā)育和形成，使砧穗間營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸提前恢復(fù)正常，進(jìn)而延長嫁接苗可溶性糖的積累時間[29]。一般而言，在干旱脅迫下植物可以通過可溶性糖的積累來增強(qiáng)植株的持水量[30]，而在土壤水分充足的條件下，可溶性糖的積累具有提高細(xì)胞滲透式，增強(qiáng)豆瓣菜需水量的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)了其根冠比的升高來促進(jìn)根系對水分的吸收。

植物對硒的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)主要由土壤硒的形態(tài)和植物自身的遺傳背景共同決定[34]。本試驗(yàn)以西蘭花為砧木對豆瓣菜進(jìn)行不同次數(shù)的嫁接后扦插發(fā)現(xiàn)，不同次數(shù)嫁接對豆瓣菜硒的分布與積累存在著明顯差異。與未嫁接的豆瓣菜扦插苗相比，一次嫁接、二次嫁接以及三次嫁接均顯著提高了豆瓣菜扦插苗根系的硒含量，而其莖稈、葉片、地上部分的硒含量以及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均隨著嫁接次數(shù)的增加呈下降趨勢，并在二次嫁接及三次嫁接的處理下顯著低于對照。這表明在硒處理土壤中，嫁接雖然有利于豆瓣菜扦插苗根系對土壤硒的吸收，但也顯著抑制了豆瓣菜將硒從根系轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分的能力，并且這種抑制作用隨嫁接次數(shù)的增加表現(xiàn)出疊加效應(yīng)。出現(xiàn)這樣的結(jié)果，可能與不同次數(shù)的嫁接處理對豆瓣菜扦插苗相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性及其硒代謝途徑具有不同程度的影響有關(guān)[35-36]，尚需進(jìn)一步深入研究。植物的硒積累量反映其對土壤硒的富集能力，與其長勢以及對硒的吸收能力密切相關(guān)。在本試驗(yàn)中，隨著嫁接次數(shù)的增加，豆瓣菜扦插苗根系及地上部分的硒積累量均表現(xiàn)出上升的趨勢，并在二次嫁接及三次嫁接的處理下顯著高于對照，這主要?dú)w功于嫁接有效促進(jìn)豆瓣菜扦插苗干物質(zhì)的積累，有利于豆瓣菜扦插苗對土壤硒的積累。

綜上所述，在硒含量為10 mg/kg的土壤中，通過嫁接處理可以在顯著提高豆瓣菜扦插苗生物量及光和色素含量的同時有效降低其MDA含量，并隨著嫁接次數(shù)的增加表現(xiàn)出一定積累效應(yīng)。隨著嫁接次數(shù)的增加，豆瓣菜扦插苗的SOD及POD活性均呈先上升后下降的趨勢，而CAT的活性則持續(xù)上升。此外，多次嫁接有利于豆瓣菜扦插苗根系、莖稈以及葉片中可溶性糖的積累，可能與多次嫁接加快了愈傷組織的形成有關(guān)，尚需進(jìn)一步深入研究。對豆瓣菜扦插苗的硒吸收而言，雖然嫁接顯著提高了豆瓣菜扦插苗根系的硒含量，但其地上部分的硒含量及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均隨嫁接次數(shù)的增加呈下降趨勢，在一定程度上抑制了硒向地上部分的轉(zhuǎn)移。盡管如此，由于嫁接對豆瓣菜扦插苗各部位的生物量具有顯著的促進(jìn)作用，從而使豆瓣菜扦插苗各部位的硒積累量在不同次數(shù)嫁接的處理下顯著高于對照，并隨嫁接次數(shù)的增加呈上升趨勢，表明多次嫁接有利于豆瓣菜扦插苗的生長和對硒的積累。