1 株兔肺源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥分析

侯 景，楊澤曉，趙 位，王 翔，晏仕強

( 四川農業大學 動物醫學院，成都 611130)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為一種存在廣泛并耐藥性嚴重的人獸共患病原菌，在臨床上主要引起創傷、呼吸道黏膜、消化道黏膜、內臟表面以及血液感染，形成化膿灶、腹膜炎和菌血癥等臨床癥狀，主要導致創口久不愈合、腹水與急性死亡[1]。在獸醫臨床上，兔金黃色葡萄球菌病是由金黃色葡萄球菌感染引起，主要表現為兔致死性傳染病和全身各器官膿腫，有的死兔出現肝臟腫大，有明顯的壞死灶，膽囊腫大，膽汁濃稠，脾臟腫大[2]，在生產上影響極大。2018年12月某養兔場送檢一批病死兔只，經臨床癥狀、剖檢病變，初診為金黃色葡萄球菌感染，為探索此次送檢病死兔病原菌的生物學特性，本研究無菌采集肺臟化膿灶進行細菌分離和純化，通過染色鏡檢、培養特性、生化試驗、動物致病試驗和分子生物學技術對分離株進行鑒定，并對分離菌株進行藥敏試驗和16S rDNA序列分析[3]，以及定性基因femb[4]、β內酰胺類耐藥基因meca、氨基糖苷修飾酶基因aph(3′)-III、aac(6′)/aph(2′)、ant(4′,4′′)[5]、萬古霉素耐藥基因plw043鑒定，以期為金黃色葡萄球菌病的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料 成都市某兔場送檢到四川農業大學動物檢疫實驗室的患病兔。

1.1.2 主要材料 營養瓊脂購自青島高科技工業園博海生物技術有限公司；血清購自成都市科隆化學品有限公司，氨芐西林、青霉素、頭孢哌酮、妥布霉素、紅霉素、四環素、多西環素、萬古霉素等19種抗生素標準藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；1×TaqMaster Mix、DL2000 DNA marker購自成都擎科生化科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；試驗小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.3 PCR擴增引物 參照文獻[3-5]設計擴增金黃色葡萄球菌16S rDNA基因、特異性基因femb、常見耐藥基因的引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 細菌分離純化 無菌采集肺部化膿性灶，劃線接種于血清瓊脂平板，37 ℃培養24 h，挑取光滑、濕潤的單菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 生化試驗 挑取經典的光滑、濕潤的單菌落進行酶觸試驗，分別接種于乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇等發酵管進行生化鑒定[6]， 37 ℃培養24～48h后觀察顏色變化。

1.2.3PCR鑒定與耐藥基因檢測 參照文獻[3-5]，提取分離菌株基因組DNA，使用表1中引物進行16SrDNA、金黃色葡萄球菌femb基因和常見耐藥基因的PCR擴增。PCR產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并取特異性擴增產物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測序結果在GenBank數據庫中進行比對[7]。

1.2.4 藥敏試驗 將鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株接種于普通瓊脂平板，37 ℃過夜培養，參照紙片擴散法對菌株進行藥物敏感性試驗，參照WS/T125-1999《中華人民共和國衛生行業標準紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》讀取結果并進行判定。

1.2.5 小鼠攻毒試驗 用2mL滅菌生理鹽水將過夜培養平板上的細菌沖洗下來，裝入無菌離心管，將菌液濃度調至2.2×1011cfu/mL，將20只小鼠隨機分為2 組，雌雄各半，試驗組腹腔注射菌液0.2mL，另一組腹腔注射0.2mL生理鹽水(對照組)，然后記錄小鼠死亡情況，同時對死亡小鼠進行剖檢，并取下肺、肝、心、脾組織，在血清瓊脂平板上進行細菌分離純化和染色鏡檢。

2 結果與分析

2.1 兔肺源金黃色葡萄球菌的分離

由圖1可見，分離菌株為雙球或短鏈狀排列的G+細菌。

圖1 分離菌株的菌落形態(A)與革蘭染色結果(B)Fig.1 Colony morphology(A) and gram staining results(B)

2.2 生化試驗

該分離菌株可發酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，與金黃色葡萄球菌生化特性結果 相符。

2.3 分離菌株PCR鑒定

16S rDNA PCR擴增得到大小為1 445 bp的條帶(圖2)，測序后在線比對結果顯示，該分離菌株16S rDNA與S.aureusJ Mub 3031菌株16S rDNA基因序列相似性為99%。金黃色葡萄球菌特異性基因femb擴增出約825 bp的特異性條帶(圖2)，測序后對比發現，與S.aureus22_LA_562菌株femb基因的序列相似性為100%。因此鑒定該分離菌株為金黃色葡萄球菌，并命名為S.aureusR18。

5種耐藥基因meca、aac(6′)/aph(2′)、aph(3′)-III、ant(4′，4′′)和plw043的PCR擴增結果顯示，耐藥基因特異性片段均被擴增到，且與預期大小相符(圖2)，測序后在線比對，結果與GenBank數據庫中相應的耐藥基因序列完全一致。

2.4 藥敏試驗

由表2可知，金黃色葡萄球菌分離株S.aureusR18僅對頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢噻吩、哌拉西林4種藥物敏感，對其他15種藥物均耐藥。該菌株在受試的19種抗菌藥中耐藥率高達78%，與耐藥基因PCR檢測結果比較發現，該菌株耐藥的表現型與基因型相符。

M.DL2000 DNA marker;1.16S rDNA;2.femb;3.meca; 4.aac(6′)/aph(2′);5.aph(3′)-III;6.ant(4′，4′′);7.plw043

圖2 分離菌株的 16S rDNA、femb基因和耐藥基因PCR檢測結果
Fig.2 PCR results ofStaphylococcusaureus16 s rDNA,fembgene, and drug-resistance gene

2.5 小鼠致病性試驗

小鼠致病性試驗結果顯示，試驗組小鼠3 d內全部死亡；對照組小鼠均正常。取試驗組死亡小鼠進行細菌分離鑒定，得到與接種菌相同的金黃色葡萄球菌。表明該分離菌株對小鼠具有較強的致病性。

表2 分離菌株藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity of S.aureus

3 討 論

金黃色葡萄球菌是一種重要的人畜共患病原菌，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染，在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可檢測到，其致病力強弱主要取決于其產生的毒素和侵襲性酶。其ClfA、FnBP等毒力因子在細菌感染過程中有重要作用[8]。該菌對營養要求不高，在普通培養基上生長良好，需氧或兼性厭氧。平板上的菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0.5～1.0 mm，其中0.8 mm左右的菌落致病性最強，且具有致病性的金黃色葡萄球菌菌株可以分解甘露醇，在本研究中，分離菌株的形態學培養特性和生化特性都與典型的金黃色葡萄球菌一致，動物試驗也證實，分離的金黃色葡萄球菌菌株S.aureusR18對小鼠具有較強的致 病性。

用16S rDNA擴增及序列分析法對分離菌進行鑒定，提高原來主要靠染色鏡檢和生化試驗進行細菌鑒定的結果準確性，目前已經成為細菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列[9]。然而作為編碼原核生物16S rDNA的基因，由交替的保守區和可變區組成，保守區為所有細菌共有，無顯著差異；可變區則具有細菌的種、屬特異性。因此，本研究在用16S rDNA 進行鑒定的同時，又引入金黃色葡萄球菌femb基因的PCR檢測。結果顯示，分離菌株16S rDNA與公布的S.aureus菌株16S rDNA的同源性超過99 %，S.aureusR18的femb基因序列與其他金黃色葡萄球菌的同源性為100%。

耐藥性金黃色葡萄球菌因具有較強的定植能力和外界環境適應能力，在全球范圍內迅速傳播。據報道，實踐中耐藥性金黃色葡萄球菌的檢出率從1980年的20%迅速升至2008年的約 60%[10]。尤其20世紀80年代報道發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌( MRSA )以來，MRSA對慶大霉素、四環素、左氧氟沙星、環丙沙星、紅霉素和利福平的耐藥率均達70 %以上[11]。陳瑤等[12]在重慶部分養殖場對5株豬源菌株、32株雞源菌株、6株牛源菌株、l0株羊源菌株和16株兔源菌株分析顯示，金黃色葡萄球菌都具有多重耐藥特性。耐藥性的產生使金黃色葡萄球菌的敏感藥物防治成為關注熱點，萬古霉素成為用于金黃色葡萄球菌感染治療的主要藥物，也取得理想的療效。萬古霉素是由一種鏈霉菌產生、結構復雜的糖肽類抗菌藥物，專一抑制肽聚糖的生物合成。臨床上主要用于耐藥菌感染的治療，可抑制革蘭氏陽性菌細胞壁的合成，對金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等作用良好[13]。然而耐受萬古霉素的菌株很快也被發現。2018年，張士法等[14]在胸外科患者術后醫院感染病原學特點及藥敏分析研究中報道，受檢金黃色葡萄球菌具有多重耐藥，且對萬古霉素的耐藥率達到100%。Bhargava等[15]研究的67株金黃色葡萄球菌均對青霉素均耐藥，所有分離菌株都對β-內酰胺酶、紅霉素、四環素、林可霉素、慶大霉素和利福平的耐藥率接近或超過60 %。本研究分離鑒定的兔源S.aureusR18菌株也具有嚴重的多重耐藥現象，除對頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢噻吩、哌拉西林4種藥物敏感外，其他15種受試的藥物全部耐藥，也包括萬古霉素高度耐受，耐受藥物比例高達 78%。耐藥基因檢測結果顯示，受檢的5種耐藥基因全部陽性，其具體耐藥性產生的機制還需要進一步研究。

本研究通過常規細菌分離鑒定技術和PCR鑒定從新近發生臨床感染的兔病例中分離到1株對小鼠具有較強致病性且具有嚴重多重耐藥性的金黃色葡萄球菌，研究結果不僅為該病的臨床診治提供可靠的參考依據，而且為金黃色葡萄球菌的耐藥機制研究提供試驗材料。