大豆種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽堿性鑒定及指標(biāo)篩選

張新草，薛項(xiàng)瀟，姜 深，王延峰，曹永策

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西延安 716000)

土壤鹽堿化不僅是一個(gè)全球性的生態(tài)問(wèn)題，同時(shí)是干旱和半干旱地區(qū)限制植物種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)和發(fā)育的一個(gè)重要因素。全世界約有10億hm2的土地表現(xiàn)出鹽堿化，中國(guó)各類(lèi)鹽堿土地的面積為9 913萬(wàn)hm2，約占全國(guó)耕地面積的10%[1-2]。尤其在中國(guó)西北地區(qū)，包括寧夏、新疆、陜西和甘肅等省常年降雨較少，水分蒸發(fā)量大，土壤鹽堿化嚴(yán)重。因此，鑒定和篩選適于鹽堿地生長(zhǎng)的植物品種(系)，具有重大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。

大豆(Glycinemax)是人類(lèi)主要的蛋白質(zhì)和食用植物油來(lái)源，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-4]。中國(guó)作為世界上最大的大豆消費(fèi)國(guó)，進(jìn)口量逐年上升，增加國(guó)內(nèi)大豆的總產(chǎn)量已刻不容緩[5]。充分利用中國(guó)大量的鹽堿土地資源，是增加大豆產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑。因此鑒定不同大豆種質(zhì)的耐鹽堿性，對(duì)于大豆耐鹽堿育種及增加大豆有效種植面積、提高大豆總產(chǎn)量具有重要的意義。雖然目前在大豆耐鹽堿種質(zhì)資源發(fā)掘方面取得許多研究進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。一是有關(guān)大豆種質(zhì)的耐鹽堿性鑒定側(cè)重在耐單一的中性鹽或堿性鹽脅迫上，耐混合鹽堿脅迫的研究較少，而混合鹽堿脅迫對(duì)植物造成的危害并不是鹽、堿脅迫危害的簡(jiǎn)單疊加，其危害程度要遠(yuǎn)大于單一的鹽或堿脅迫[6-7]；二是大豆種質(zhì)耐鹽堿性的鑒定方法多種多樣，不同研究者鑒定所用的指標(biāo)也不盡相同[8-10]。因此，建立一種操作簡(jiǎn)單、指標(biāo)明確的鑒定方法有重要意義。

種子發(fā)芽期是植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的初始階段，發(fā)芽階段的耐鹽堿性對(duì)其能否在鹽堿地中存活與生長(zhǎng)發(fā)育起到至關(guān)重要的作用[11-12]；且種子發(fā)芽期的一些形態(tài)指標(biāo)(如發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)等)因測(cè)定方法簡(jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)種質(zhì)耐鹽堿性的研究中[13-16]。為此，本試驗(yàn)利用18份特異的大豆種質(zhì)資源，在種子發(fā)芽階段進(jìn)行混合鹽堿脅迫處理，利用主成分分析、隸屬函數(shù)和多元回歸等統(tǒng)計(jì)方法對(duì)各種質(zhì)的不同指標(biāo)進(jìn)行分析，旨在篩選出優(yōu)異耐鹽堿材料與重要的大豆耐鹽堿性評(píng)價(jià)指標(biāo)，為大豆耐鹽堿育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

共選取18份大豆特異種質(zhì)為試驗(yàn)材料(表1)。

表1 供試大豆品種(系)Table 1 Tested soybean cultivars (lines)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

釆用人工氣候箱對(duì)供試的18份大豆種質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，條件為光照/黑暗時(shí)間15 h/9 h，溫度為28 ℃/24 ℃。挑選大小一致、子粒飽滿的種子，用75%酒精消毒30 s，然后用去離子水沖洗(3～5次)干凈，將種子表面水分吸干，放置于事先鋪好濾紙的培養(yǎng)皿中(直徑9 cm)，每培養(yǎng)皿20粒。每個(gè)培養(yǎng)皿加入12 mL的60 mmol/L(預(yù)試驗(yàn)篩選出的脅迫濃度)混合鹽堿(NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 9∶1∶1∶9，物質(zhì)的量之比)溶液，并在種子的上表面覆蓋一張濾紙，每2 d更換1次培養(yǎng)皿內(nèi)的溶液和濾紙。以蒸餾水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。自培養(yǎng)第2天起，以幼苗根長(zhǎng)度大于或等于種子長(zhǎng)度的一半作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，并在處理6 d后測(cè)定其他形態(tài)指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

種子培養(yǎng)3 d后考察發(fā)芽勢(shì)，培養(yǎng)6 d后考察發(fā)芽率，并取發(fā)芽狀況較好且均勻一致的3株幼苗測(cè)量幼苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量。其中：

發(fā)芽勢(shì)=3 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率=6 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 21和Excel 2016數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各指標(biāo)值進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)和指標(biāo)間的相關(guān)性分析；利用主成分分析、隸屬函數(shù)和多元回歸等方法對(duì)供試材料的耐混合鹽堿性進(jìn)行鑒定和級(jí)別歸組，并篩選耐鹽堿性的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

首先計(jì)算各個(gè)種質(zhì)在各個(gè)指標(biāo)上耐鹽堿性測(cè)度——耐鹽堿系數(shù)(Saline-alkali tolerance coefficient,SATC)：

SATCij=yij(SA)ij(CK)

其中：yij(SA)和ij(CK)分別為混合鹽堿脅迫和對(duì)照條件下不同種質(zhì)i(i=1,2,…,18 )在j(j=1,2,…,7)指標(biāo)上觀測(cè)值的平均數(shù)。

根據(jù)各指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)，分析指標(biāo)間相關(guān)性。分析不同耐鹽堿系數(shù)間可能存在的信息交叉和重疊。

對(duì)所有耐鹽堿系數(shù)進(jìn)行主成分分析，以對(duì)變量進(jìn)行降維。并提取累積貢獻(xiàn)率大于85%的前P個(gè)主成分(綜合指標(biāo))替代原來(lái)的耐鹽堿系數(shù)用于大豆耐鹽堿性評(píng)價(jià)。

計(jì)算不同材料在前P個(gè)主成分上的值，并利用隸屬函數(shù)法將這些值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(標(biāo)度到區(qū)間[0，1])。

μ(FiP)=(FiP-min(FP))/(max(FP)-min(FP))

式中：μ(FiP)表示種質(zhì)i(i=1,2,…,18 )在第P個(gè)主成分(綜合指標(biāo))上標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值；FiP表示第i個(gè)種質(zhì)在第P個(gè)主成分上的值；max(FP)和min(FP)分別為所有種質(zhì)在第P個(gè)主成分上的最大值和最小值[17-19]。

根據(jù)主成分貢獻(xiàn)率的大小，求出各個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重。

式中：ωP表示第P個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的權(quán)重，φP為第P個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

根據(jù)綜合指標(biāo)在不同材料中的隸屬函數(shù)值和各綜合指標(biāo)的權(quán)重，計(jì)算出18份材料耐鹽堿性的綜合評(píng)價(jià)值(D值)(即所有材料在各個(gè)主成分上的標(biāo)準(zhǔn)化得分的加權(quán)平均數(shù))。

以綜合D值對(duì)18份材料的耐鹽堿性進(jìn)行分類(lèi)。標(biāo)準(zhǔn)為:(0-0.2]，極端敏鹽堿；(0.2-0.4]，敏鹽堿；(0.4-0.6]，中等；(0.6-0.8]，耐鹽堿；(0.8-1.0]，極端耐鹽堿。

最后以綜合D值為因變量，各指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)為自變量進(jìn)行回歸分析，建立回歸方程。篩選出快速評(píng)價(jià)大豆種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽堿性的形態(tài)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽期指標(biāo)

在60 mmol/L混合鹽堿脅迫下，18份特異種質(zhì)的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量的均值相較于對(duì)照組分別降低了132.9%、121.1%、97.9%、158.0%、 32.1%、161.8%和330.1%(表2)。表明混合鹽堿脅迫對(duì)調(diào)查的各個(gè)指標(biāo)均有負(fù)向效應(yīng)，能夠抑制種子發(fā)芽和幼苗的早期生長(zhǎng)。

2.2 各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)及相關(guān)性分析

由表3可知，在混合鹽堿處理下，不同大豆種質(zhì)的各單項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照相比均有所下降，各指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)均小于1，但不同指標(biāo)在種質(zhì)間的變化幅度和排列順序不同。由此可見(jiàn)，使用單個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)大豆種質(zhì)的耐鹽堿性，結(jié)果通常具有局限性，不夠準(zhǔn)確。

由表4可知，大豆發(fā)芽期各指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)間存在不同程度的相關(guān)性。其中，相對(duì)幼苗長(zhǎng)與相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)幼苗長(zhǎng)與相對(duì)苗鮮質(zhì)量、相對(duì)幼苗長(zhǎng)與相對(duì)根鮮質(zhì)量、相對(duì)根長(zhǎng)與相對(duì)苗鮮質(zhì)量、相對(duì)根長(zhǎng)與相對(duì)根鮮質(zhì)量、相對(duì)苗鮮質(zhì)量與相對(duì)根鮮質(zhì)量、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)與相對(duì)發(fā)芽率之間存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)；相對(duì)根鮮質(zhì)量與相對(duì)發(fā)芽勢(shì)之間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。各指標(biāo)耐鹽堿系數(shù)的相關(guān)性體現(xiàn)了這些指標(biāo)間的內(nèi)在聯(lián)系，研究結(jié)果反映出不同指標(biāo)所提供的信息存在著嚴(yán)重交叉與重疊，因此有必要對(duì)指標(biāo)進(jìn)行降維分析。

表2 不同處理下大豆種質(zhì)發(fā)芽期各指標(biāo)值的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statisticalanalysis of indicators under different treatments of soybean at germination stage

注：SD=標(biāo)準(zhǔn)差。

Notes:SD= standard deviation.

表3 各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)Table 3 Mixed saline-alkali tolerance coefficient of each indicator

表4 耐鹽堿系數(shù)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of mixed saline-alkali tolerance coefficients

注：*P<0.05；**P<0.01。

Notes：*P<0.05; **P<0.01.

2.3 耐鹽堿系數(shù)的主成分分析

對(duì)大豆發(fā)芽期的幼苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率7個(gè)指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)進(jìn)行主成分分析。結(jié)果表明，上述7個(gè)單項(xiàng)耐鹽堿系數(shù)可以轉(zhuǎn)化為3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)(F1、F2和F3)。3個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為57.016%、19.881%和12.537%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)89.434%，表明這3個(gè)綜合指標(biāo)幾乎反映了原來(lái)7個(gè)指標(biāo)所代表的全部信息(表5)。

表5 主成分的特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and cumulative contribution of principal component

2.4 大豆發(fā)芽期耐鹽堿性的綜合評(píng)價(jià)

由F1、F2和F33個(gè)綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率計(jì)算出各指標(biāo)的權(quán)重，可知各主成分的相對(duì)重要性。結(jié)果顯示3個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.638、0.222和0.140。根據(jù)各綜合指標(biāo)在不同材料中隸屬函數(shù)值和指標(biāo)權(quán)重的大小，計(jì)算出不同大豆種質(zhì)的耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)值(D值)。結(jié)果表明，18份種質(zhì)的D值為0.150到0.870，C10的D值最大，表明其耐鹽堿性最強(qiáng)；C14的D值較小，表明其對(duì)鹽堿最為敏感(表6)。最終將18份大豆種質(zhì)的耐鹽堿性劃分為5類(lèi)，其中極端耐鹽堿和極端鹽堿敏感的材料份數(shù)相同，均為2份，分別占總數(shù)的11.1%；中等耐鹽堿的材料最多，為9份，占 總數(shù)的50.0%；耐鹽堿的材料共3份，占總數(shù) 的16.7%；敏鹽堿的材料共2份，占總數(shù)的 11.1%。

表6 各大豆種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽堿性的綜合評(píng)價(jià)Table 6 Comprehensive evaluation of saline-alkali tolerance of each soybean germplasm at germination stage

2.5 回歸模型建立及鑒定指標(biāo)篩選

為分析7個(gè)指標(biāo)與大豆品種之間的耐鹽堿性關(guān)系，篩選出能夠客觀鑒定大豆發(fā)芽期耐鹽堿性的指標(biāo)，建立可用于大豆發(fā)芽期耐鹽堿性評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型。將耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)值(D值)作為因變量，把7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽堿性系數(shù)作為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，建立回歸方程:

D=-0.365+0.808X7+0.772X1+ 0.364X4

方程決定系數(shù)R2=0.994，P<0.001，式中X1、X4和X7分別代表幼苗長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量和發(fā)芽率的耐鹽堿系數(shù)。由此方程可知，7個(gè)參評(píng)指標(biāo)中發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)和根鮮質(zhì)量3個(gè)指標(biāo)對(duì)大豆耐鹽堿性有顯著性影響，在相同條件下可作為快速評(píng)價(jià)大豆種質(zhì)耐鹽堿性的重要指標(biāo)。

3 結(jié)論與討論

本研究基于不同指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)，利用相關(guān)性分析、主成分分析和和耐逆性綜合評(píng)價(jià)D值等分析方法對(duì)18份大豆種質(zhì)耐鹽堿性進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)D值的大小將18份種質(zhì)的耐鹽堿性劃分為5類(lèi)，其中極端耐鹽堿材料2份，分別是‘隴中黃606’和‘延豆9號(hào)’；耐鹽堿材料3份，‘冀豆1708’‘晉黃10號(hào)’和‘魯LH678’；中等耐鹽堿材料9份，分別是‘寧黃29’‘泛豆G98’‘陜豆3號(hào)’‘晉科6號(hào)’‘秦豆8號(hào)’‘陜豆7號(hào)’‘中黃30’‘中品16456’和‘中作J16J270’；敏鹽堿材料2份，分別是‘電白黑豆’和‘汾豆105’；極端鹽堿敏感材料2份，分別是‘邯豆16’和‘石335’。研究結(jié)果可為大豆耐鹽堿育種及鹽堿地開(kāi)發(fā)利用提供材料基礎(chǔ)。同時(shí)本研究構(gòu)建了耐鹽堿性評(píng)價(jià)的回歸方程，篩選出發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)和根鮮質(zhì)量3個(gè)指標(biāo)可作為快速評(píng)價(jià)大豆種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽堿性的重要指標(biāo)。在相同逆境條件下，也可測(cè)定這3個(gè)指標(biāo)，利用該回歸方程快速預(yù)測(cè)其他種質(zhì)的耐鹽堿性，為大豆種質(zhì)耐鹽堿性鑒定及耐逆育種提供重要的 信息。

鹽堿地常可分為鹽地、堿地或含多種鹽堿成分的混合鹽堿地[20]。以往有關(guān)大豆種質(zhì)耐鹽堿性的鑒定研究多是基于單一的中性鹽(NaCl等)或堿性鹽(Na2CO3等)[8,10,12,21-22]，但前人研究結(jié)果表明，混合鹽堿脅迫對(duì)植物造成的危害程度要遠(yuǎn)大于單純中性鹽或堿性鹽脅迫[23-24]。因此只采用單一的中性鹽或堿性鹽進(jìn)行脅迫試驗(yàn)，得到的結(jié)果對(duì)于分析大豆耐鹽堿機(jī)制以及指導(dǎo)耐鹽堿改良育種均具有一定的局限性。尤其在中國(guó)西北干旱半干旱區(qū)，土壤鹽堿化嚴(yán)重，且鹽化與堿化往往相伴發(fā)生，土壤成分中既有堿性鹽，又有中性鹽[25]。其中，氯化鹽和碳酸氫鹽是西北地區(qū)兩種重要的鹽堿成分[26]。因此本研究以NaCl和Na2CO3兩種鹽為主、Na2SO4和NaHCO3兩種鹽為輔混合配置混合鹽堿溶液，用來(lái)模擬復(fù)雜的鹽堿脅迫環(huán)境，相對(duì)單一的中性鹽或堿性鹽來(lái)講，更能真實(shí)地反映田間鹽堿脅迫的實(shí)際情況。

大豆種質(zhì)的耐鹽堿性是一個(gè)復(fù)雜性狀，有時(shí)單一指標(biāo)并不能全面評(píng)價(jià)其耐鹽堿性。但對(duì)復(fù)雜性狀使用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，又會(huì)因?yàn)樾誀铋g的相關(guān)性造成評(píng)價(jià)不準(zhǔn)確[8，13,27-28]。本研究結(jié)果也顯示了多個(gè)指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)間存在極顯著或顯著的相關(guān)性，且不同單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)在不同種質(zhì)中的大小排序也有所不同，表明利用單個(gè)或多個(gè)相關(guān)的單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)大豆種質(zhì)的耐鹽堿性進(jìn)行評(píng)價(jià)均具有一定局限性。因此本研究基于不同指標(biāo)的耐鹽堿系數(shù)，利用主成分分析和耐逆性綜合評(píng)價(jià)等分析方法對(duì)18份大豆種質(zhì)耐鹽堿性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在數(shù)據(jù)處理與耐性評(píng)價(jià)過(guò)程中，既降低了指標(biāo)間代表信息的交叉與重疊，同時(shí)也考慮了綜合指標(biāo)重要性的差異，更有助于客觀的評(píng)價(jià)大豆種質(zhì)的耐鹽堿性。并且本研究通過(guò)回歸分析構(gòu)建的大豆種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽堿性的評(píng)價(jià)模型和篩選出的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，在相同條件下也能夠?yàn)榭焖兕A(yù)測(cè)其他種質(zhì)的耐鹽堿性提供依據(jù)。但在本試驗(yàn)中，僅對(duì)18份大豆種質(zhì)發(fā)芽期耐鹽堿脅迫進(jìn)行了相關(guān)的試驗(yàn)，對(duì)種質(zhì)的耐鹽性和耐堿性及在其他生育期的耐鹽堿性仍有待在后續(xù)工作中繼續(xù)研究。