歐盟農藥內分泌干擾物評價策略簡介

2020-05-09 08:25:46申繼忠

世界農藥 2020年4期

申繼忠

(1.上海艾農國際貿易有限公司，上海 220122；2.江蘇耘農化工有限公司，江蘇鎮江 212132)

就全球范圍而言，歐美最早展開內分泌干擾物相關工作。中國也于2015年頒布了《農藥內分泌干擾作用評價方法》農業行業標準。

美國環保局 1996年開始著手內分泌干擾物篩選工作。內分泌干擾物篩選項目(EDSP)使用兩級辦法篩選農藥、化合物和環境污染物對雌激素、雄激素和甲狀腺激素系統的潛在影響。EPA發布了包含在EDSP中的52個化合物的篩選結果。第一階段篩選本來包括67個物質。但是，后來有15種被登記持有人撤銷或終止，不再使用，因此不再被篩選。在這52個化合物中，有20個化合物被證明對內分泌途徑有潛在影響；有14個化合物顯示出對一種或多種內分泌途徑有潛在影響，EPA已經有足夠資料得出結論，它們不構成風險(即通過第一階段評審)。剩余的 18個化合物都表現出對甲狀腺途徑有潛在影響，其中 17個化合物對雄激素通路有影響，14個化合物對雌激素通路有潛在影響(18個化合物需進行第二階段評審)。

歐盟自 1999年就開始內分泌干擾物戰略(Strategy on Endocrine Disruptors)。后來歐盟的化學品立法都將這一戰略考慮在內。2013年被歐洲議會和歐盟委員會采納的第 7版環境行動項目(The 7th Environment Action Programme，簡稱EAP)規定了統一的有危害的內分泌干擾物鑒定標準。歐盟農藥新法規[Regulation (EC) 1107/2009]和殺生物劑法規[Biocidal Products Regulation (EU) 528/2012]要求建立內分泌干擾物鑒定標準。因此，殺生物劑內分泌干擾物鑒定標準[Commission Delegated Regulation(EU) 2017/2100]于2017年9月4日發布，從2018年6月 7日開始實施。農藥內分泌干擾物鑒定標準[Commission Regulation (EU) No 2018/605]則于2018年4月19日發布，從2018年11月10開始實施。

2018年6月歐盟頒布了在殺生物劑法規和農藥法規背景下的內分泌干擾物鑒定指導[Guidance for the identification of endocrine disruptors in the context of Regulations (EU) No 528/2012 and (EC) No 1107/2009]。該指導的第3部分是其核心內容：即評價某種物質是否滿足內分泌干擾物標準的策略(Strategy to assess whether a substance meets the endocrine disruptor criteria)。

該指導的目的是為執行殺生物劑和植物保護劑法規中規定的 ED標準提供技術指導。該指導服務對象是登記申請人和農藥主管當局評審員。

該指導的內容包括⑴ 內分泌干擾物定義，即與ED標準一樣，采用WHO/IPCS(國際化學品安全規劃署)的內分泌干擾物定義：“內分泌干擾物是一種外源物質或混合物，能改變內分泌系統的功能，從而對一個完整的生物體或其后代或(亞)群體造成不利的健康影響”。⑵ 該指導覆蓋雌性激素(estrogen)、雄性激素(androgen)、甲狀腺(thyroid)和類固醇的合成方式(steroidogenesis)，這4項統稱EATS模式的內分泌干擾作用機制。但是，對于可獲得的具有非EATS(Non-EATS modalities)作用機制的內分泌干擾作用的信息也要予以考慮。⑶ 該指導覆蓋對脊椎動物，即哺乳動物(包括人類)、魚類和兩棲動物的內分泌干擾作用，即對人和非靶生物的影響。

本文重點介紹該指導提出的內分泌干擾物標準和評價策略。

1 內分泌干擾物標準

歐盟殺生物劑法規[Regulations (EU) No 528/2012]和農藥法規[Regulations (EC) No 1107/2009]分別要求對殺生物劑(biocides)和農藥進行內分泌干擾特性評價。之后又分別發布了確定殺生物劑和農藥之內分泌干擾特性的科學標準[Commission Delegated Regulation (EU) 2017/2100和Commission Regulation (EU) 2018/605]。

確定內分泌干擾性質的標準有兩套，一是對人，二是對非靶標生物。這兩套標準都被進一步分為兩部分：第一部分是對 ED進行定義，第二部分是確定ED性質需要考慮的信息。

第一部分是定義在什么情況下某種物質可以被認為具有干擾內分泌性質。這部分對人和非靶標生物都是一樣的。

根據 ED標準，如果某種物質同時符合下列 3項標準，則該物質應被視為具有內分泌干擾性質。3項標準為：⑴ 該物質對某種完整的有機體(或其后代)或非靶標生物顯示出某種或多種不利影響。這種不利影響包括形態、生理、生長、發育、繁殖變化或生物體壽命、系統或(子)群變化。這些變化能導致功能性能力的損傷，這種能力的損傷可彌補額外的壓力或對其他因素的敏感性的增加；⑵ 該物質具有內分泌活性，即它能改變內分泌系統的功能；⑶ 上述不利影響與評價出來的內分泌活性之間有生物學合理性聯系。

需要分別針對人類和非靶標生物而得出是否滿足 ED標準的結論。內分泌干擾作用的識別策略需從回答以下兩個問題開始：⑴ 內分泌活性與所觀察到的與人類有關的有害影響之間是否存在生物學上可信的聯系；⑵ 內分泌活性與所觀察到的在種群水平上的對非靶標生物體的不良影響之間是否存在生物學上可信的聯系。

上述兩個問題都必須得到解答，并且根據法規(EC) No 1107/2009和法規(EU) No 528/2012的要求，對人類和非靶標生物的內分泌干擾作用都必須得出結論。

為評價對人和非靶標生物的內分泌干擾作用所需要的信息有很多重疊。哺乳動物數據總與非靶標生物的 ED評價有關。更有甚者，從非靶標生物得到的信息也可能與人的ED評價有關。

第二部分規定了確定(包括對人和非靶生物)ED性質時需要的信息。根據ED標準，“所有可得到的相關數據”都必須考慮在內，ED標準規定采用證據權重方法對科學數據予以評價。

評價內分泌干擾特性的標準規定：在應用證據加權時，對科學證據的質量、可靠性、重現性和一致性的評估要特別考慮表1中的所有因素。針對人類或針對非靶標生物體的內分泌干擾特性的評估需要考慮的因素不同(表1)。

表1 ED標準中列出的在證據加權評價中必須考慮的因素

2 內分泌干擾物評價策略

2.1 確定評價策略的總原則

評價策略的制定是為了有效地利用可獲得的數據，總的原則是對ED 的評價始于對現有數據的利用。前提是數據必須符合殺生物劑(農藥)法規要求。其次，只有在必要時才能產生進一步的數據。第三是對哺乳動物/人以及非靶標生物的作用的可獲得的信息要在評價中全面使用。

2.2 確定憑借策略的法規和技術依據

⑴ 殺生物劑和植物保護劑的內分泌干擾物標準(Commission Delegated Regulation (EU) 2017/2100和Commission Regulation (EU) 2018/605)。

⑵ 關于內分泌干擾物測試和評價的 OECD概念框架(OECD CF)：在其中列出可用于評價物質之內分泌干擾作用的OECD測試指導和其他標準的測試方法。提供測試方法使用指導，但不是測試策略。

⑶ 關于內分泌干擾物評價標準化試驗指導的OECD指導文件150(OECD GD 150)。它有助于解釋ED測試中獲得的結果(參數)。

2.3 五步評價策略

2.3.1 總策略

⑴ 為了研究內分泌活性，應采用分步進行的方法，使用表2列出的測試數據，并考慮到現有的信息，遵循圖1所述的策略。

⑵ 該策略建議進行表2列出的第2級測試即離體測試(或使用來自文獻的等效信息)，以減少動物測試，以促進MoA分析。

⑶ 按照圖 1的策略，當離體測試結果為陽性時，就足以進行作用機制(MoA)分析。

⑷ 然而，如果離體試驗為陰性，由于內分泌系統的復雜性和目前離體試驗的局限性，這通常也不足以證明被試物質沒有活體測試內分泌活性(因此需要進一步的活體試驗)。

表2 推薦的調查EATS-有關的內分泌活性的試驗方法

2.3.2 評價策略之第一步：搜集所有相關信息

所有相關信息包括但不限于：⑴ 依據標準指導進行研究獲得的數據；⑵ 其他科學數據，包括非標準試驗數據、QSAR模型和交叉參照(read-across approaches)獲得數據、離體方法獲得數據、數據庫數據、流行病數據、田間、監測和種群模擬數據等。

其次要根據農藥和殺生物劑等法規之規定對數據質量進行評價。把有效研究數據(參數)根據其與ED評價的相關性歸為如下各組：⑴ 活體方式(in vivo mechanistic)；⑵ 離體方式(in vitro mechanistic)；⑶ EATS-介導的方式(EATS-mediated)；⑷ 對 EATS敏感，但不作為對EATS的診斷。

2.3.3 評價策略之第二步：收集、評價和整合證據鏈

在搜集所有可獲得的信息后，分組整合證據鏈:

⑴ 收集和評價來自如下方面的有害影響證據鏈：① “EATS-介導”的參數；② “對 EATS敏感”，但不作為對EATS的診斷的參數。

⑵ 收集和評價來自如下方面的內分泌活性證據鏈：① “離體試驗”參數；②“活體試驗”參數；③“EATS-介導的”參數(活體參數)；④ 整合有害影響和內分泌活性兩方面證據鏈；⑤ 報告數據鏈。

2.3.4 評價策略之第三步：證據的初步分析

通過對證據的分析，可以得出3種結論：

⑴ 在下面情況下，可以得出“不符合ED標準”的結論：① “EATS-介導”的參數得到充分研究但是沒有觀察到EATS介導的有害影響；或者 ②內分泌活性得到充分研究但是沒有觀察到內分泌活性(而且沒有EATS介導的有害影響)。

⑵ 在下面情況下轉向作用機制(MoA)分析：①觀察到EATS介導的有害影響；或② 觀察到內分泌活性。

⑶ 在下面情況下，需要生成新的信息(數據)：沒有發現 EATS介導的有害影響而且沒有觀察到內分泌活性，但是內分泌活性沒有得到充分研究。

2.3.5 評價策略之第四步：作用機制(MoA)分析

當潛在的與內分泌有關的有害影響和內分泌活性被確定后，則兩者之間的生物學合理性聯系必須得到確立(利用現代科學知識和證據權重方法)。這種“生物學合理性聯系”就是作用機制。內分泌干擾物的作用機制(MoA)是指能導致特定有害影響的一系列生物學事件(KE)，這些事件產生有害影響。至少這些生物學事件之一牽涉到內分泌干擾系統的一個或多個要素。

MoA分析步驟：

⑴ 首先假定有害影響和/或內分泌活性作用機制(MoA)，如表3。

⑵ 建立生物學合理性聯系，可能是如下一種或幾種：① EATS-介導的有害影響；② 對EATS參數敏感但不能作為診斷依據的有害影響；③ 基于非-EATS內分泌參數的有害影響；④ 多作用機制；⑤替代性非-內分泌作用機制。

⑶ 考慮哪些進一步的信息有助于闡明假定的作用機制。

⑷ 另外還要考慮非-內分泌或非-EATS介導的作用機制。

⑸ 所獲得證據對作用機制分析全面評價的支持程度。

⑹ 得出MoA分析的結論。

2.3.6 評價策略之第五步：所評價物質是否符合ED標準的結論

⑴ 根據足夠的數據集，沒有觀察到“EATS-介導”的有害作用，或者內分泌活性呈陰性，則可以忽略(by-passed)作用機制(MoA)分析，從而得出不符合ED標準的結論。

⑵ 如果某種作用機制(MoA)是基于“EATS-介導”的有害影響，那么就被認為符合ED標準，除非證明替代性非-內分泌作用機制是更好的解釋。

⑶ 如果某種作用機制是建立在“對EATS敏感性而非診斷性”有害作用的基礎上，并且大量證據支持有害作用和內分泌活性之間的生物學合理性聯系，那么就認為符合ED標準，除非證明替代性非-內分泌作用機制是更好的解釋。

2.3.7 草甘膦案例

2016年，歐盟委員會要求歐洲食品安全局考慮該農藥潛在的內分泌活性信息。評估報告說：“目前的評估得出的結論是，大量證據表明，草甘膦不會通過雌激素、雄激素、甲狀腺或類固醇生成的方式干擾內分泌。該研究基于毒理學領域的全面數據庫。”食品安全機構2017年9月7日發布的評估報告發現，沒有證據表明草甘膦對人體激素系統有有害影響。歐洲食品安全局(EFSA)得出結論，世界上使用最多的農藥草甘膦不具有內分泌干擾特性。這一結果也與美國環境保護署在2015年6月得出的結論一致。

圖1 在內分泌干擾物評估背景下調查EATS-有關的內分泌活性的試驗策略

表3 假定的作用機制(MoA)舉例

但是，一項新的研究表明，草甘膦制劑(農達)是一種成年雄性大鼠內分泌干擾物。測試發現最低劑量10 mg/kg bw/d的草甘膦可降低大鼠皮質脂酮水平，皮質脂酮是腎上腺產生的類固醇激素。因為沒有發現草甘膦在這種劑量下有其他毒性作用，所以如果沒有專門研究草甘膦對內分泌的影響，就不會有其他跡象表明這種劑量的草甘膦有毒。研究人員并沒有針對更低劑量水平的農達進行測試，因此不知道在內分泌紊亂方面是否存在“安全”的低劑量農達。在技術上，這意味著沒有發現 NOAEL(沒有觀察到的不良影響水平)。

3 評價內分泌干擾物所需信息來源

根據上述內分泌干擾物評價策略可知，收集各種信息，包括試驗數據、文獻數據以及各種非試驗數據等。表4歸納了該指南給出的評價內分泌干擾物需要收集的信息來源。

表4 支持內分泌干擾物評價的信息來源

此外，OECD GD150提供了各種分級測試方法指導，共分為5級。很多數據都是由這些試驗產生。為便于參考，特將這些方法指導列出(表4-8)。

表5-9所列是OECD測試指導和現有的標準測試方法。所列方法不完全是目前內分泌干擾物評價策略所要求的，只是提供現有的測試方法名單以及它們所能提供的信息。由于內分泌干擾領域仍在發展中，因此，這些方法也要經歷不斷變化。目前美國環保局內分泌干擾物篩選項目(EDSP)采取的兩級篩選體系所用的方法中的某些方法未來可能由替代方法所取代(表10)。

表5 第一級測試方法(現有數據好而非測試信息)

4 結語

歐盟內分泌干擾物鑒定指導為申請者和主管機構的評價者提供進行 ED評價或評估的指導。該評價策略的建立是為了有效地利用可用的數據。針對殺生物劑登記所要求的核心數據集可能足以進行ED評價，只有當必要時才進行更多數據的生產。對EATS-介導的有害影響的知識可能足以進行作用機制(MoA)分析并對內分泌活性與有害作用之間的生理上的合理性聯系做出結論。