心臟死亡大鼠供體角膜移植排斥模型建立

曹 倩，李 蘭，鄒 瑩，李云川，李 勇，龍俊君，劉浩文，何柳余，田二苗

（昆明市第一人民醫院眼科，云南昆明 650032）

我國有大量的角膜盲患者，角膜移植術是其唯一的復明方式。目前，我國心臟死亡供體捐獻（donation after cardiac death，DCD）角膜是角膜移植植片的主要來源[1]。而角膜移植術后免疫排斥仍是手術失敗的主要原因[2-3]，因此角膜移植術后排斥反應的防治成為角膜移植領域研究的熱點。既往制備心臟死亡供體的動物實驗方法包括注射氯化鉀、麻醉+呼吸機撤除（窒息）、放血以及電擊誘導心臟驟停等。這些方法或可能存在藥物因素影響，或提前產生器官的缺血損傷，或與臨床DCD供者的死亡模式差異較大，難以模擬臨床實際情況[4]。大鼠由于角膜MHC抗原的表達與人類角膜相似，實驗抗原購買方便，相比其他實驗動物價格低，且比小鼠角膜移植難度低，眼科研究中常用大鼠眼球做動物模型[5]。目前大鼠角膜移植動物模型多是參考Williams的方法[6]。本實驗參考了既往實驗的基本方法，對一些造模細節有所改進及創新，總結了影響心臟死亡大鼠供體角膜移植排斥模型建立的關鍵步驟及注意事項，供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雌性SD大鼠，體重220～250 g，無眼部疾患[由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004]均取右眼作為手術眼，保留左側正常眼不影響大鼠術后進食。實驗動物的使用和喂養遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》[7]。

1.1.2 主要試驗試劑及儀器設備 主要試劑：10%水合氯醛、0.9%生理鹽水、聚維酮碘、Optisol角膜保存液、慶大霉素注射液、妥布霉素眼膏。

主要設備：體視顯微鏡、角膜移植手術器械、維納斯剪。

1.2 方法

50只成年雌性SD大鼠按照隨機數字表隨機分為供體組（10只，20眼）、實驗組（同種異體角膜移植組20只，20眼）、對照組（自體角膜移植組20只，20眼）。

1.2.1 供體準備 供體植片準備：成年雌性SD大鼠，體重220～250 g，使用5 mL注射器抽取5 mL空氣，戴棉線手套固定好大鼠頭部及尾部，防止抓傷。于大鼠左側肋骨角偏左上方心臟方向處進針，回抽見血液確定穿刺部位位于心腔，注射5 mL空氣處死SD大鼠，從而建立心臟死亡模型。將大鼠左側臥位，頭部固定于自制的大鼠頭部固定枕上，見圖1A、圖1B，使眼部處于與手術臺平行位置。術前使用5%～10%聚維酮碘消毒結膜囊3 min以上[8]，0.9%生理鹽水再次沖洗結膜囊。顯微有齒鑷固定9點方向角膜鞏膜緣，使眼球呈輕度脫臼狀態。1 mL注射器于3點方向穿刺入前房，維納斯剪順著穿刺點進入前房沿角膜緣360°剪下全層角膜供體。將供體角膜上皮面朝上放于4.25 mm環鉆臺中央鋪好后，將環鉆壓于環鉆臺上制作植片，植片制作完畢后置于Optisol保護液中備用。

1.2.2 同種異體角膜移植（實驗組）采用10%水合氯醛3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉，麻醉生效后同供體準備方法，維納斯剪順著穿刺點進入前房沿角膜緣360°剪下4.0 mm受體角膜植片（可用液氮保存），制作好植床。將供體植片置于受體植床上，見圖2A，使用12-0國產顯微縫線進行間斷縫合8針，線節不埋藏，前房內注入空氣約0.1mL形成前房，見圖2B。術畢，結膜下注射慶大霉素注射液0.1 mL，結膜囊內點妥布霉素眼膏，6-0縫線縫合眼瞼中部防止術后大鼠抓撓眼部引起感染。

1.2.3 自體角膜移植（對照組）采用10%水合氯醛3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉，麻醉生效后操作同供體準備方法，維納斯剪順著穿刺點進入前房沿角膜緣360°剪下4.25 mm角膜植片，旋轉180°后，見圖3A，使用12-0國產顯微縫線進行間斷縫合8針，線節不埋藏，其他處理同同種異體角膜移植，見圖3B。

圖3 同種自體角膜移植Fig.3 Autologous corneal transplantation

1.2.4 術后處理 術后24 h剪開眼瞼縫線，點妥布霉素眼膏，1次/d。術后體式顯微鏡下觀察并拍照。建模成功標準：術后3 d內無植片傷口裂開，無前房、眼內感染等并發癥發生；術后1周內每日觀察1次，1周后隔日觀察1次，并記錄角膜植片的混濁指數、水腫指數及新生血管指數并評分，直至術后14 d取材。

按照Larkin DF[9]的標準，由同一醫生進行排斥反應評分，三項評分之和為排斥指數（rejection index，RI），當RI≥6，確定為排斥，見表1。

1.3 統計學處理

使用SPSS軟件對結果進行統計學分析。統計實驗組、對照組大鼠術后14 d排斥反應評分，計量資料用（）表示，用t檢驗。差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 角膜移植術后排斥反應評分標準Tab.1 Scoring criteria for rejection after corneal transplantation

2 結果

2.1 角膜植片觀察

實驗組（同種異體角膜移植組）排斥反應率較對照組（自體角膜移植組）顯著增高。

實驗組：共20只大鼠，1只大鼠于術后1 d死亡，其余19只大鼠術后第1～3天角膜植片輕度混濁、基質水腫，第6～7天切口處出現新生血管，后向植片中心生長，植片混濁、基質水腫逐漸加重，術后14 d取材，術眼均發生排斥反應，排斥反應指數均≥6。評分7分（植片混濁度分4分+植片水腫度2分+植片新生血管度1分=7分），見圖4。排斥反應率為100%。對照組共20只大鼠，術后第1～3天角膜植片輕度混濁、基質水腫，第6～7天混濁及水腫逐漸消退，術后第14天取材，術眼植片未出現新生血管，排斥反應指數均＜6。

2.2 實驗組、對照組術后7 d、14 d角膜植片評分

實驗組、對照組大鼠角膜移植術后7 d、14 d植片評分情況，術后7 d排斥反應評分實驗組為（4.5±0.65）分，對照組為（4.0±0.25）分，差異無統計學意義（t=1.966，P=0.077 6），術后14 d排斥反應評分實驗組為（8.5±2.12），對照組為（3.0±0.32）分經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.871，P=0.0045），見表2。

2.3 實驗組、對照組術后排斥反應指數對比

實驗組術后8 d左右開始出現排斥反應，持續時間長、排斥反應重。術后14 d取材，實驗組排斥反應評分為（8.5±2.12）分，對照組排斥反應評分為（3.0±0.32）分，經t檢驗，P=0.004 5，差異有顯著統計學意義，見圖5。

圖4 實驗組大鼠術眼角膜植片排斥圖Fig.4 Exclusion of corneal grafts in rats

表2 兩組大鼠角膜移植術后7 d、14 d植片評分情況［（），n=20］Tab 2 Rat corneal transplantation in the experimental and control group ［（），n=20］

表2 兩組大鼠角膜移植術后7 d、14 d植片評分情況［（），n=20］Tab 2 Rat corneal transplantation in the experimental and control group ［（），n=20］

圖5 實驗組、對照組術后同時間排斥反應指數折線圖Fig.5 The index line diagram of the experimental group and the control group after operation

3 討論

心臟死亡供體模型多采用小型豬制作，但目前尚無適用于大鼠的心電監測及呼吸機設備可用于實驗，亦未見心臟死亡大鼠模型的建立報道。本文采用心腔內注射空氣直接造成心臟死亡，參考Williams[6]制作大鼠角膜移植的方法制作大鼠心臟死亡供體角膜移植排斥反應模型，改進了部分造模細節、關鍵步驟及流程。方法簡單易行，可操作性強。

3.1 減少感染

減少感染，保證實驗過程無菌條件，縮短手術時間大鼠角膜直徑約6 mm，前房極淺，晶體呈球形，角膜移植手術操作難度大，一旦術后發生感染將直接造成模型制作失敗，因此保證造模后術眼不感染是最重要的。大鼠角膜移植過程中眼內容物虹膜晶體等暴露的時間越長，術后感染幾率越大，動物實驗過程中需嚴格無菌操作以減少術后感染發生的幾率。大鼠顱骨解剖特點決定了實驗時眼部無法與試驗臺保持平行，視野聚焦不清楚，會增加眼內容物脫出的風險，本實驗中研究小組自制的大鼠頭枕可以將大鼠頭部固定牢固且保證眼位，為手術創造適宜條件，縮短大鼠眼部“開窗”時間，從而減少術后眼內炎發生幾率。同時銳利的手術器械和熟練的操作對于縮短手術時間也非常重要。受體麻醉劑的選擇，目前多選擇使用3%戊巴比妥1.5 mL/kg或10%水合氯醛3.5～4.2 mL/kg[10-11]。本研究選擇10%水合氯醛3 mL/kg進行腹腔麻醉，麻醉效果及麻醉深度好，能保證角膜移植手術順利進行。首都醫科大學基礎醫學院報道了水合氯醛、烏拉坦、戊巴比妥三種常用麻醉劑對長爪沙鼠麻醉效果觀察，發現水合氯醛與戊巴比妥比較，麻醉期較長、誘導期更短，對心跳呼吸頻率影響更小[12]。

3.2 增加角膜移植排斥幾率

本實驗中角膜移植排斥幾率為100%。影響人眼角膜移植排斥的因素有：受體原發角膜病變，是否為再次角膜移植，是否為高危角膜移植，角膜植片大小[13-14]。大鼠模型中可控因素為植片大小、縫線、術后處理。植片大小的選擇文獻報道大部分為3 mm[15]。應根據實驗目的選擇植片大小，如果實驗目的為獲取排斥角膜植片進一步研究則可選4.25 mm直徑環鉆，因為角膜植片越大，術后排斥反應幾率越大，4.25 mm直徑植片標本體積大，也更利于進一步分析。大部分文獻顯示縫線選擇10-0縫線[16]本文中使用國產12-0尼龍線，對比進口10-0縫線而言，粗細、韌度相當，針尾較10-0縫線粗，優勢是價格為進口縫線的1/20。本研究術后使用妥布霉素眼膏，術后未發生眼內炎，術后10d左右開始出現排斥反應。既往研究中有使用抗生素眼液+糖皮質激素眼膏方案[17]，但具體頻次尚無統一標準。本研究中術后每日使用妥布霉素眼膏，操作次數減少，在保證動物模型成功的前提下減少了工作量，術后使用糖皮質激素眼膏可以降低排斥反應發生率，為增加術后排斥反應率可不必使用糖皮質激素眼膏，僅用抗生素眼膏，術后14 d可出現明顯排斥反應。

綜上所述，心臟死亡大鼠角膜移植排斥反應模型制作的關鍵步驟為：固定大鼠頭位、麻醉劑的選擇、銳利的手術器械及熟練的顯微手術操作技巧，保證在盡可能短的時間內完成手術，減少術后感染發生率；選擇直徑4.25 mm大小植片、12-0國產尼龍縫線（價格低廉）、術后僅使用抗生素眼膏預防感染。