Meprinα 對TGF-β1誘導的成纖維細胞膠原合成的調節作用

王 珺，張 乙，張詩匯，靳馥宇，李 田，徐 洪

（華北理工大學基礎醫學院/河北省器官纖維化重點實驗室，河北唐山 063210）

課題組前期研究發現，N-乙酰-絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰 -脯氨酸（n-acetyl-serylaspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）能夠顯著拮抗矽肺大鼠肺纖維化，在體外能夠抑制轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1介導膠原合成和肌成纖維細胞分化[1-2]。Ac-SDKP來源于胸腺素β4，其中內肽酶meprinα 是胸腺素β4水解成為Ac-SDKP的關鍵酶之一[3-4]。Meprin屬于金屬蛋白酶超家族，含有α 和β兩個亞基，能夠水解基質膜蛋白、細胞因子、緊密連接蛋白、生長因子、蛋白激酶等多種成分，一些研究認為Meprin在器官纖維化中發揮了重要的調節作用[5-6]。因此本研究擬通過體外原代培養肺成纖維細胞，并予以TGF-β1誘導向肌成纖維細胞分化，觀察重組Meprinα 對肺成纖維細胞膠原合成和肌成纖維細胞轉化的調節作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）（10099141，美國GIBCO公司）；胎牛血清（BI-SH0019，以色列BI公司）；GAPDH兔多克隆抗體（sc-25778，美國Santa Cruz公司）；I型膠原（ab34710，英國Abcam公司）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab32575）、M eprin α（ab232892）；重組 TGF-β1蛋白（240-B，美國R&D公司）、重組Meprin α 蛋白（4007-ZN，美國R&D公司）、放線酰胺素（Actinonin，c3331，美國APExBIO公司）。

1.2 細胞培養及分組

采用貼壁法培養肺成纖維細胞，取新生1～3 d乳鼠，取肺組織剪成小塊兒，采用血清平鋪于培養瓶底，翻轉放置6 h。待細胞爬出呈次融合狀態時，傳代，取3～4代細胞進行實驗。同步化24 h后，細胞分組為：（1）對照組：無血清培養；（2）TGF-β1誘導組：無血清培養條件下，予以5 ng/mL TGF-β1誘導；（3）Meprin α 預處理組：無血清培養條件下，先予以100μmol/L Meprin α預處理1 h，再給予5 ng/mL TGF-β1共誘導；（4）Actinonin預處理組：無血清培養條件下，先予以20μmol/L actinonin預處理1 h，再給予5 ng/mL TGF-β1共誘導。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖

按照5×103/ 孔將細胞種植于96孔板，同步化后按照實驗設計分組并誘導，24 h后每孔加入10μL CCK溶液，細胞培養箱中孵育1 h，酶標儀于450 nm測定吸光度。

1.4 劃痕實驗

以2×105/孔的密度將細胞種植于24孔板，同步化后使用200μL槍頭劃痕，按照實驗設計分組并誘導，分別于0 h、48 h倒置顯微鏡下拍照，采用IPP 6.0圖像分析軟件測定劃痕區域面積，遷移率計算公式

1.5 免疫細胞熒光染色

細胞常規爬片，高壓修復，血清封閉1 h，滴加α-SMA一抗（1:200）4℃過夜，次日二抗37℃孵育1 h，含DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察掃圖。

1.6 免疫印跡

每25 cm2培養瓶加入100μL細胞裂解液，冰上靜置15 min，刮取細胞移至EP管，12 000 g離心15 min取上清。Brafford法測定蛋白濃度，10μg/ 泳道上樣，常規電泳和電轉。孵育Meprin α、α-SMA、I型膠原一抗（1:1 000）4 ℃過夜，二抗（1:5 000）37℃1h后，ECL發光顯色，采用Image-Lab 5.1軟件定量分析條帶，目的條帶的OD值經相應內參平衡后與對照組的比值作為該蛋白的相應表達量。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 重組Merpin α 能夠抑制TGF-β1介導的肺成纖維細胞的增殖

與對照組相比較，TGF-β1誘導組的OD值增加；與TGF-β1誘導組相比較，Merpin α 預處理組的OD值減小，經方差分析差異均具有統計學意義（P＜0.05）；而Actinonin預處理組OD值與TGF-β1誘導組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 重組Merpin α 能夠抑制TGF-β1介導的肺成纖維細胞的遷移

與對照組的相比較，TGF-β1誘導組的遷移率增高；與TGF-β1誘導組相比較，Merpin α 預處理組的遷移率降低，Actinonin預處理組遷移率升高，經方差分析差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.3 重組Merpin α 能夠抑制TGF-β1介導的肺成纖維細胞的I型膠原和α-SMA的表達

見圖2、圖3、表2所示，與對照組比較，TGF-β1誘導組I型膠原、α-SMA表達水平顯著上調，Merpin α 表達水平顯著下調，免疫熒光染色顯示α-SMA陽性表達，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4、表3。與TGF-β1誘導組相比較，Merpin α 預處理組的I型膠原、α-SMA表達水平顯著下調；如圖4、表4所示，與TGF-β1誘導組相比較，Actinonin預處理組I型膠原、α-SMA表達水平顯著上調，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 重組Meprin α 和Actinonin對TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖和遷移的影響（）Tab.1 The effects of meprin α and actinonin on cell proliferation and cell migration in lung fibroblasts induced by TGF-β1（）

表1 重組Meprin α 和Actinonin對TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖和遷移的影響（）Tab.1 The effects of meprin α and actinonin on cell proliferation and cell migration in lung fibroblasts induced by TGF-β1（）

與對照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1誘導組比較，#P ＜0.05。

表2 TGF-β1對Meprin α 表達的調節作用（）Tab.2 The effect of TGF-β1 on the expression of meprin α（）

表2 TGF-β1對Meprin α 表達的調節作用（）Tab.2 The effect of TGF-β1 on the expression of meprin α（）

表3 重組Merpin α 對TGF-β1介導的COL I和α-SMA的調節作用（）Tab.3 The regulation of recombinant meprin α on the ex pression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表3 重組Merpin α 對TGF-β1介導的COL I和α-SMA的調節作用（）Tab.3 The regulation of recombinant meprin α on the ex pression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表4 Actinonin對TGF-β1介導的COL I和α-SMA的調節作用（）Tab.4 The regulation of actinonin on the expression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

表4 Actinonin對TGF-β1介導的COL I和α-SMA的調節作用（）Tab.4 The regulation of actinonin on the expression of COL I and α-SMA induced by TGF-β1（）

3 討論

圖1 重組Merpin α 抑制TGF-β1介導的肺成纖維細胞的遷移Fig.1 Merpin α inhibits fibroblasts migration induced by TGF-β1

圖2 重組Merpin α 對TGF-β1介導的α-SMA表達的調節作用Fig.2 The effect of merpin α on the expression of α-SMA in lung fibroblast induced by TGF-β1

圖3 TGF-β1對Merpin α 表達的調節作用Fig.3 The effect of TGF-β1on the expression of merpin α in lung fibroblast induced by TGFβ1

圖4 重組Merpin α 和Actinonin對TGF-β1介導的COL I和α-SMA的調節作用Fig.4 The effect of merpin α and actinonin on the expression of COL I and α-SMA in lung fibroblasts induced by TGF-β1

Meprins屬于金屬蛋白酶家族，包含兩個α、β亞基，可以各自或與對方聚合形成寡聚蛋白，其中包含α 亞基的稱為Meprin A蛋白，多定位于膜上或形成可溶性Meprin α 蛋白而分泌到細胞外基質[5-6]。研究表明，Meprin α 在腎小管上皮細胞中強表達，能夠水解胸腺素β4形成Ac-SDKP，是體內Ac-SDKP合成的主要來源之一[3-5]。課題組多年圍繞Ac-SDKP的抗矽肺纖維化作用進行了系列研究，發現Ac-SDKP及其相關血管緊張素系統關鍵調節肽能夠抑制肌成纖維細胞分化，包括肺泡II型上皮細胞，抑制細胞外基質沉積從而發揮拮抗矽肺大鼠肺纖維化的作用[1，2，7-9]，因此推測，Meprin α 可能在體內具有調節膠原代謝的作用。

研究表明，Meprinα、β亞基能夠水解I型膠原前肽，誘導原纖維組裝，促進膠原成熟；Mep1a-/-和Meplb-/-基因敲除小鼠較野生型小鼠相比較，皮膚膠原纖維排列不規則，厚度降低，提示Merpins能夠調節皮膚膠原代謝[10]。與野生型小鼠相比較，Mep1a-/-、Meplb-/-和雙基因敲除小鼠博來霉素染毒后肺功能、炎癥指標差異并不顯著，但Meplb-/-基因敲除小鼠較野生型小鼠其膠原沉積水平降低，提示Meprinβ可能與肺纖維化的形成關系較為緊密[11]。在針對肺動脈高壓的研究中也發現，Meprin α 能夠抑制炎癥細胞及炎癥介質對血管內皮細胞的損傷作用[12]。而在腫瘤微環境的研究中，關于Meprin α 的作用機制尚不明確，甚至有爭論。這些研究多認為，Meprin α 可水解炎性介質、膠原蛋白和生長因子，可以執行激活或失活各類活性物質的作用[13-15]，但其在纖維化疾病中的具體作用機制，尚未完全了解。

在本研究中，給予重組Merpin α 預處理，能夠顯著抑制肺成纖維細胞的增殖、遷移，并抑制其向肌成纖維細胞分化和膠原沉積，提示Merpin α 具有抗纖維化作用的潛能。課題組最近的研究也顯示，Merpin α 可被血管緊張素轉化酶2、血管緊張素（1-7）信號所激活，從而促進Ac-SDKP的生成，減輕矽肺纖維化病變程度，抑制肌成纖維細胞分化[9]。上述結果說明，外源性給予重組merpin α 能夠調節膠原代謝。由于merpin α 的器官定位、細胞定位以及形成寡聚蛋白成分不同，其作用機制可能不同，仍需進一步研究確定。