UPLC-Q-Exactive測定茶葉中的氟蟲腈及其代謝物

李宇翔， 李燕平， 李少光， 楊 艷

中國是世界上第一產茶葉大國，茶葉產品暢銷國內外。但是近年來茶葉農藥殘留問題日益嚴重，同時國際市場尤其是歐盟和日本這兩大市場卻啟用了更嚴格的農藥殘留限量標準，使農藥殘留成為茶葉出口的主要限制因素。雖然氟蟲腈在茶樹上未被登記使用過，但卻在出口茶葉中多次檢出[1]。2017年荷蘭毒雞蛋事件發生后，氟蟲腈成為歐美國家重點關注的農藥殘留之一，日本市場甚至對我國的烏龍茶實施氟蟲腈重點檢查[1]。

氟蟲腈是一類苯基吡唑類廣譜殺蟲劑，由于其具有殺蟲類別廣，殺蟲效果好，時效長，不影響作物生長等優勢被廣泛用作多種作物的殺蟲劑[2]。氟蟲腈穩定性較差，在使用過程中會產生氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜等。氟蟲腈及其代謝物的大劑量的攝入會造成人體肝功能、甲狀腺及腎臟損傷[3]。研究表明，作為代謝物之一的氟蟲腈砜對淡水生物的毒性比氟蟲腈高6倍以上[4]。因此，測定氟蟲腈的同時也需要測定其代謝產物。

我國也逐漸重視氟蟲腈的測定。目前文獻報道測定茶葉中氟蟲腈的方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法等[4-10]。文獻還未發現UPLC-Q-Exactive法測定茶葉中的氟蟲腈及其代謝物。因此，本研究旨在建立運用較為成熟的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)農藥殘留快速檢測方法[11-12]，與UPLC-Q-Exactive儀器聯用，通過一級全掃(full mass spectrometry/target-select iron monitoring，Full MS/t-SIM)定量，二級平行監測(parallet-reaction-monitoting，PRM)進行定性分析，快速、準備、靈敏地檢測和篩查出茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑 氟蟲腈標準品(批號：7783741)、氟甲腈標準品(批號：4427363)、氟蟲腈砜標準品(批號：160021)、氟蟲腈亞砜標準品(批號：4092033)均購自美國迪馬公司；氯化鈉(批號：20170413)、無水硫酸鈉(批號：20180615)均購自國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺(PSA)(批號：030982-TE)、C18粉(批號：030982-TE)均購自美國Thermo公司；乙腈、甲醇均購自德國默克公司。

1.1.2儀器 液相色譜質譜聯用儀(Thermo UltiMate 3000 UPLC-Q Exactive，美國Thermo公司)；離心機(ALLEGRA X-30，美國貝克曼庫爾特公司)；純水機(MILLIPORE Milli-Q8，美國Milli-pore公司)；數控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1樣品處理 通過優化文獻方法[13]，將商品化的茶葉樣品攪碎至粉末狀，再稱取茶葉樣品2 g于50 mL離心管中，加20 mL乙腈，渦旋混勻30 s，超聲提取15 min，加入2 g氯化鈉和6 g無水硫酸鈉，渦旋2 min，9 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入50 mg PSA粉末、50 mg C18粉末和250 mg無水硫酸鈉，渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL加水0.5 mL，渦旋30 s，過0.25 μm有機濾膜，待測定。

1.2.2標準溶液的配制

1.2.2.1氟蟲腈及其代謝物標準儲備液的配制 分別精密稱取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準品0.01 g，用乙腈溶解并定容于100 mL量瓶，終濃度為100 mg/L。氟蟲腈及其代謝物混合標準使用液的配制：準確稱取0.1 mL標準儲備液(100 mg/L)，用乙腈溶解并定容于100 mL量瓶，終濃度為100 μg/L。

1.2.2.2氟蟲腈及其代謝物混合標準曲線的配制 取適量混合標準工作液，用空白基質溶液配制成濃度為0.1，0.2，0.5，1，2 μg/L的標準工作曲線，臨用現配。

1.2.3儀器條件

1.2.3.1色譜條件 色譜柱：Thermo Syncronis C18柱( 100 mm×2.1 mm，1.7 μm )；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相 A為甲醇，B為純水溶液，梯度洗脫程序：0 ～0.5 min，90%A；0.5～2.5 min，90% ～ 5%A；2.5～4 min，5%A；4～4.1 min，5%～90%A；4.1～6 min，90%A。

1.2.3.2質譜條件 掃描模式1：Full MS/t-SIM(150～2 000 m/z)；分辨率：70 000；采集極性：Negative；AGC target：1e6；Maximun IT：50 ms；電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；毛細管溫度320 ℃；噴霧電壓：3.20 kV；鞘氣流速：40 arb；輔氣流速：15 arb。掃描模式2：PRM(200～800 m/z)；分辨率：17 500；采集極性：Negative；AGC target：2e5；Maximun IT：100 ms。

2 結 果

2.1氟蟲腈及其代謝物的定性鑒定 通過Full MS/t-SIM和PRM對氟蟲腈標準品進行定性考察，獲得其實際精確母離子和子離子質核比信息、色譜峰的保留時間，快速初篩出空白基質樣品[14]。兩種模式下基質空白圖譜見圖1，2，未檢出任何峰型信息。氟蟲腈及其他3種化合物的相關文獻信息及質譜測定信息見表1。測得實際精確分子量與理論精確分子量的偏值均<5×10-6，可以確認為目標化合物。

表1 氟蟲腈及其代謝物高分辨質譜鑒定參數表

△：質量偏差P等于理論值T與實際值的差值與理論值的比值．

2.2線性、檢出限及定量限 按照1.2項下方法做基質標準曲線，線性范圍為0.1～2 μg/L，其中Full MS Scan Type(線性ya)的相關系數為0.996 0～0.997 6，PRM Scan Type(線性yb)的相關系數為0.995 9～0.999 8。計算當信噪比為3倍(S/N≥3)時的溶液濃度為檢出限，信噪比為10倍(S/N≥10)時的溶液濃度為定量限。兩種不同檢測模式的檢出限和定量限見表2。兩種掃描模式的標準加標色譜及質譜圖見圖3，4。

表2 氟蟲腈及其代謝物線性關系、范圍、檢出限以及定量限

y：標準品相對響應值；x：標準品含量；LODs：檢出限；LOQs：定量限．

2.3回收率、精密度 通過使用前期篩查的空白基質樣品進行加標回收率試驗，每種化合物分別添加3種不同濃度的標準物質(0.5，1.0，2.0 μg/kg)，每個平行測定6次(n=6)，按2.1項下處理方法進行處理，并進質譜分別進行Full MS/t-SIM和PRM模式的定性定量分析，結果見表3。Full Mass掃描模式下測得氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為90.2%～106.7%，RSD值為2.035%～5.438%；PRM模式下的平均回收率為92.0%～103.2%，RSD值為1.075%～5.930%。

2.4實際樣品測定 按食品抽樣方法，隨機抽取全省190份茶葉樣品,按1.2.1～1.2.3項下處理方法對樣品進行測定。用氟蟲腈及其代謝物的標準品進行定性定量。結果表明，190份樣品檢出43份(按本方法的檢出限計算，包含超出國家限量指標)，一級母離子精確質量偏差<5×10-6，陽性樣品Full MS質譜圖見圖5，質譜圖見圖6。

表3 氟蟲腈及其代謝化合物的回收率、精密度

Tab 3 The average recovery, precision of fipronil and its metabolites in tea

化合物加標濃度(μg·kg-1)平均回收率/%Full MS PRM相對偏差RSD/%Full MSPRM氟蟲腈0.592.995.43.7493.4581.090.292.02.0351.6212.094.195.63.0675.930氟甲腈0.596.992.33.1102.6531.091.795.82.7621.0752.090.793.82.6081.846氟蟲腈砜0.596.4101.94.1701.5741.0103.097.05.4382.4182.0105.9101.03.8323.748氟蟲腈亞砜0.597.993.42.8193.6031.0101.4103.03.7425.0182.0106.7103.24.9032.809

n=6. Full MS：一級全掃；PRM：二級平行監測．

3 討 論

由于食品基質的復雜性及涉及多組分、同類型化合物結構的相似性，普通低分辨率串聯質譜儀無法準確分離定性，因而常出現假陽性。傳統的檢測方法已無法滿足日常的檢測要求。高分辨質譜儀在一定程度上彌補了這個缺陷，被廣泛地應用于農藥的快速篩查[15]。Q Exactive高分辨質譜儀通過四極桿與Obitrap串聯，提高了定性能力，同時其定量能力達到了三重四極桿的定量效果[16]。本方法基于四極桿-靜電場/軌道阱質譜的高分辨能力，可有效地排除樣品基質效應的影響，與傳統三重四極桿質譜儀相比，其分辨率高，對化合物的質核比能夠精確至小數點后5位，具有排他性，因而可以進行準確的一級定量。同時本方法也對樣品進行PRM模式的測定，通過對陽性樣品精確的二級子離子掃描(子離子m/z精確至小數點后5位)，進一步對目標化合物進行確證，從而消除假陽性的可能性。兩種掃描模式的聯合運用，保證了方法的定量準確和定性可靠。結果表明，本方法分析時間短，靈敏、準確，檢出限均能達到0.02 μg/L，可以滿足各種茶葉中氟蟲腈及其3種代謝物的快速測定要求，有一定的推廣價值。但是由于本研究篩查組分少，未考慮流動相及色譜柱的選擇，并且氟蟲腈及其代謝物在4 min同時出峰，考慮后期加入更多的組分，在之后的試驗應逐步優化色譜條件，提高儀器的效率及分辨能力。