Notch信號通路對前列腺癌PC-3細胞增殖侵襲和遷移能力的影響

李傳貴， 王 強

(河北省保定市第一中心醫院泌尿外一科， 河北 保定 071000)

前列腺癌(prostate cancer)是西方男性最常見的腫瘤疾病，每年發病超16萬，死亡約2.7萬，是北美和歐洲男性癌癥死亡的第三大原因[1]。前列腺癌的高發區主要在西方發達國家，但是近年中國男性前列腺癌的發病率有逐年上升的趨勢[2]。Notch信號通路是一條介導相鄰細胞間相互作用的高度保守的信號通路，其由Notch受體、配體以及細胞內效應分子組成，廣泛存在于各種生物中。研究表明，在非小細胞肺癌中， Notch配體DLL4可促進腫瘤血管的發育和成熟，改善其結構和功能，促進腫瘤的生長[3]；研究發現65%以上的T細胞極性淋巴細胞白血病(T-ALL)患者的Notch1基因呈高表達，可直接激活MYC的表達，Notch1和MYC調節前饋環路中的常見轉錄靶標，促進T-ALL腫瘤細胞的增殖和自我更新，提示Notch信號通路的激活可促進某些腫瘤的發生發展[4]。但是Notch信號在前列腺癌中的作用機制以及下游分子機制仍然有待于進一步闡明，本文通過研究阻斷和激活Notch信號通路對前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移的影響和作用機制，為前列腺癌的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑:前列腺癌PC-3細胞購自ATCC細胞庫，DAPT購自Sigma公司，過表達Notch1胞內段病毒AdNICD腺病毒和對照AdCtrl病毒購自漢恒生物，DMEM培養基、胎牛血清購自Gibico公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液購自碧云天公司，Trizol購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自Takara公司，EdU試劑盒購自廣東銳博公司，Matrigel (1∶8稀釋)基質膠購自BD公司，Transwell小室購自Millipore公司，4%多聚甲醛購自谷歌生物公司，5 %結晶紫購自Sigma公司，AKT和P-AKT抗體(1∶1000稀釋)購自CST公司，二抗HRP標記抗兔IgG (1:2000稀釋)購自CST公司。

1.2細胞培養和細胞感染:用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養前列腺癌PC-3細胞。取對數生長期的PC-3細胞，離心后培養基重懸，以5×105細胞/孔密度接種于含有圓玻片的24孔板。12h細胞貼壁后加入50μM的DAPT，DMSO作為對照組；或者12h細胞貼壁后加入AdNICD和AdCtrl對照腺病毒，8h換液，48h后進行后續實驗。每組設3個復孔。

1.3qRT-PCR:細胞培養72h后，利用Trizol法提取總RNA，并檢測其濃度和純度。后續根據mRNA反轉錄試劑盒的說明書進行反轉錄。以反轉錄后的產物作為模板，進行實時定量PCR實驗。內參GAPDH上游引物為：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物為：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'；Hes1上游引物為：5'-AAGAAAGATAGCTCGCGGCAT-3'，下游引物為：5'-CCAGCACACTTGGGTCTGT-3'；Hes5上游引物為：5'-AGCTACCTGAAGCACAGCAAAG-3'，下游引物為：5'-AGGCACCACGAGTAACCCTC-3'。

1.4EdU實驗檢測細胞增殖能力:添加DAPT和DMSO或AdNICD和AdControl處理72h后，棄廢舊培養基，根據EdU試劑盒說明書進行實驗。將A液與培養基按1∶1000稀釋，將配好的培養基加入24孔板，于培養箱中孵育2h。棄培養基，PBS洗三次，加入4%PFA室溫固定30min。棄固定液，加入2%甘氨酸中和，使用Apollo室溫染色30min。染核，封片，熒光顯微鏡下觀察。每組設3個復孔。

1.5Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力:DAPT組和DMSO組或AdNICD組和AdCtrl組每組分別設3個小室，每小室提前鋪入Matrigel基質膠。將處理72h后的PC-3細胞以1×105/孔的密度接種于Transwell小室中，下層為完全培養基，培養24h后取出小室。4%PFA室溫固定20min，利用5%結晶紫染色20min，PBS洗三遍，熒光顯微鏡下觀察。

1.6劃痕實驗檢測細胞遷移能力:DAPT組和DMSO組或AdNICD組和AdCtrl組每組分別以1×106/孔的密度將細胞接種于六孔板(背面用筆提前畫好直線)，繼續培養24h，用1mL槍頭垂直于板底和直線劃痕。PBS洗三次，加入培養基繼續培養，于0和24h取樣拍照。每組設3個復孔。

1.7Western blot檢測蛋白水平變化:使用RIPA裂解法提取細胞總蛋白，經SDS-PAGE電泳后，PVDF轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1-2h，一抗于4℃孵育過夜，室溫孵育二抗2h，經化學發光后進行結果分析。

2 結 果

2.1qRT-PCR驗證DAPT阻斷和AdNICD激活Notch信號通路的效率:通過qRT-PCR實驗對DMSO和DAPT或AdCtrl和AdNICD處理過的前列腺癌PC-3細胞中的Notch信號通路的下游靶分子Hes1和Hes5的含量進行檢測，結果顯示，DAPT加入PC-3細胞作用72h后，Hes1和Hes5的mRNA水平顯著下調(圖1A，*P<0.001，#P<0.05)，表明DAPT阻斷Notch信號通路有效。AdNICD作用PC-3細胞72h后，Hes1和Hes5的mRNA水平顯著上升(圖1B，*P<0.01，#P<0.05)，表明NICD有效激活Notch信號通路。

2.2EdU實驗檢測添加DAPT和AdNICD對PC-3細胞增殖能力的影響:將PC-3細胞分為兩組，分別添加DMSO和DAPT或AdNICD和AdCtrl，作用72h后對其進行EdU實驗，檢測細胞增殖能力的變化。結果顯示，添加DAPT作用72h后前列腺癌PC-3細胞的增殖能力下降(圖2A，P<0.01)；感染AdNICD作用72h后前列腺癌PC-3細胞的增殖能力增強(圖2B，P<0.05)。

圖1 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路的效率

注：A.前列腺癌PC-3細胞添加DAPT后，采用qRT-PCR檢測Notch信號通路的下游靶分子Hes1和Hes5的表達水平變化，驗證阻斷Notch信號通路的效率；B.前列腺癌PC-3細胞感染AdNICD后，采用qRT-PCR檢測Notch信號通路的下游靶分子Hes1和Hes5的表達水平變化，驗證激活Notch信號通路的效率。

圖2 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后PC-3細胞增殖能力變化

注：A.前列腺癌PC-3細胞添加DAPT后，采用EdU實驗方法檢測細胞增殖能力變化；B.前列腺癌PC-3細胞轉染AdNICD后，采用EdU實驗方法檢測細胞增殖能力變化。

2.3Transwell小室實驗檢測添加DAPT和AdNICD對PC-3細胞侵襲能力的影響:將PC-3細胞分為兩組，分別添加DMSO和DAPT或AdNICD和AdCtrl，作用72h后對其進行transwell小室實驗，檢測細胞侵襲能力的變化。結果顯示，DAPT處理后細胞的侵襲能力減弱(圖3A，P<0.01)；AdNICD感染后細胞侵襲能力增強(圖3B，P<0.05)。

圖3 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后PC-3細胞侵襲能力變化

注：A.前列腺癌細胞PC-3添加DAPT后，采用Transwell小室實驗方法檢測細胞侵襲能力變化；B.前列腺癌PC-3細胞轉染AdNICD后，采用Transwell小室實驗方法檢測細胞侵襲能力變化。

2.4劃痕實驗檢測添加DAPT和AdNICD對PC-3細胞遷移能力的影響:將PC-3細胞分為兩組，分別添加DMSO和DAPT或AdNICD和AdCtrl，作用72h后對其進行劃痕實驗，檢測細胞遷移能力的變化。結果顯示，DAPT組細胞遷移能力下降(圖4A，P<0.01)；感染AdNICD后細胞遷移能力增強(圖4B，P<0.01)。

圖4 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后PC-3細胞遷移能力變化

注：A.前列腺癌細胞PC-3添加DAPT后，采用劃痕實驗方法檢測細胞遷移能力變化；B.前列腺癌PC-3細胞轉染AdNICD后，采用劃痕實驗方法檢測細胞遷移能力變化。

2.5Western blot檢測添加DAPT和AdNICD作用于PC-3細胞后AKT信號通路的變化:DAPT和AdNICD分別作用于PC-3細胞72h后，收集細胞提取蛋白，進行Western blot實驗，檢測AKT信號通路分子的表達水平變化。結果顯示，添加DAPT后，細胞的磷酸化AKT蛋白表達水平明顯下降，但總AKT蛋白表達水平無明顯變化(圖5A，P<0.01)；感染AdNICD后，細胞的磷酸化AKT蛋白表達水平明顯升高，但總AKT蛋白表達水平無明顯變化(圖5B，P<0.05)。

圖5 DAPT阻斷或NICD激活Notch信號通路后AKT信號通路相關分子水平變化

注：A.前列腺癌細胞PC-3添加DAPT后，采用Western blot實驗方法檢測AKT信號通路的變化；B.前列腺癌PC-3細胞轉染AdNICD后，采用Western blot實驗方法檢測AKT信號通路的變化。

3 討 論

前列腺癌目前已經成為我國男性的常見疾病，國內前列腺癌發病呈現顯著的地域差異，發達地區發病率增加尤為顯著，同時，前列腺癌的生存率較差，尤其是廣大農村地區。國內前列腺癌發病率的增高和人口老齡化、生活方式西方化有關[5]。前列腺癌在所有癌癥中的預后最差，2012年在全球癌癥死亡率方面排名第二，有證據表明這可能是由于前列腺癌更傾向于轉移，淋巴結和骨骼是70～80%前列腺癌相關死亡病例中轉移的目的地。然而，目前缺乏對晚期或轉移性前列腺癌的有效治療，導致患者的高死亡率。雄激素剝奪治療是轉移性前列腺癌的一線標準治療，但是大部分患者應用雄激素治療后2～3年內發展成為趨勢抵抗性前列腺癌[6]。晚期或轉移性前列腺癌在臨床上缺乏有效的治療手段，如何提高患者生存率，延長生存期成為前列腺癌研究領域的熱點。

Notch信號通路在癌癥的發生發展中起著重要作用，調控紊亂可引起組織發育異常，可能導致腫瘤的發生，對腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、血管生成等過程發揮重要作用[7]。而具體的致癌或抑癌作用根據癌癥類型而不同，例如，對腦部腫瘤起始細胞(brain tumor-initiating cells，BTICs)的研究發現肌腱蛋白C(Tenascin C，TNC)激活Notch信號通路，從而調控其增殖和成球能力[8]；關于三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer ，TNBC)的研究發現miR-3178靶向調控Notch1抑制上皮細胞-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal ，EMT)而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[9]；另外，Notch1可激活AKT信號通路，部分通過直接激活主要穹窿蛋白(major vault protein，MVP)促進EMT[10]。而在前列腺癌中，已有研究表明Jagged1在晚期前列腺癌組織中表達上調，Jagged1和Notch1的表達水平在轉移和復發的前列腺癌中明顯高于正常前列腺組織和初發前列腺癌，提示Notch信號通路的激活可能對前列腺癌的發展具有促進作用[11]。

研究表明，阻斷Notch信號通常與前列腺癌的增殖相關，同時能夠抑制癌細胞的克隆球形成能力，促進對化療的敏感性，但是對腫瘤細胞的遷移和侵襲研究較少[12]。Notch信號通路的激活需要γ-分泌酶對受體進行切割，γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor，GSI)DAPT可阻斷Notch信號通路。本研究對前列腺癌PC-3細胞加入DAPT后，RT-PCR實驗結果顯示前列腺癌PC-3細胞的Hes1、Hes5的mRNA水平較對照組明顯下降，提示干預有效。對細胞進行EdU檢測發現，DAPT組的細胞增殖能力減弱，后續的Transwell和劃痕實驗顯示，DAPT組的列腺癌細胞系PC-3侵襲和遷移能力降低。實驗證實，DAPT阻斷Notch信號通路后前列腺癌細胞系PC-3的增殖、侵襲和遷移能力減弱。相反，前列腺癌PC-3細胞感染過表達Notch1胞內段病毒AdNICD腺病毒后，細胞的增殖、侵襲和遷移能力增強。

Notch信號作用于前列腺癌細胞的下游分子機制。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、血管生成等過程中發揮重要作用。研究發現AKT信號通路與前列腺癌的進展密切相關，42%的原發性前列腺癌和所有的轉移性腫瘤中發現了AKT通路的改變[13]。DAPT阻斷Notch信號通路后，前列腺癌PC-3細胞的AKT磷酸化水平下降，感染AdNICD激活Notch信號通路后，前列腺癌PC-3細胞的AKT磷酸化水平升高，我們的研究顯示，阻斷/激活Notch信號分別降低/增加AKT磷酸化水平，提示Notch信號通路調控前列腺癌細胞行為可能通過活化AKT通路實現的。

綜上所述，本研究證實，阻斷/激活Notch信號通路分別抑制/促進前列腺癌細胞PC-3的增殖、侵襲和遷移能力；此外，Notch信號通路激活與AKT磷酸化水平呈正相關。在前列腺癌細胞中，Notch信號可能通過調控AKT信號通路從而影響細胞增殖、侵襲和遷移，進而影響前列腺癌進展。本研究結果為下一步體內實驗的進行提供了基礎，也為前列腺癌新的分子治療策略提供了理論依據。