miR-655-3p在頭頸鱗狀細胞癌中的表達改變及其臨床意義

趙 雷，趙寶建，冉 程，陳向紅，田從哲

(河北大學附屬醫院耳鼻咽喉科，河北 保定 071000)

頭頸鱗狀細胞癌是耳鼻咽喉-頭頸外科中常見的惡性腫瘤，主要包括喉癌、喉咽癌、口腔癌、鼻咽癌等。據資料統計，2015年我國頭頸鱗狀細胞癌新發病例占所有癌癥新發病例的3.1%，而死亡病例占所有癌癥死亡病例的2.8%[1]。由于癌組織局部復發和遠處轉移，使得頭頸鱗狀細胞癌的預后較差，其5年生存率約為50%[2]。因此，進一步探求頭頸鱗狀細胞癌相關特異性腫瘤標志物及分子治療新靶點則具有極為重要的意義。而微小RNA(microRNA，miRNA)作為重要的生物學功能調控分子，在包括頭頸鱗狀細胞癌在內的多種腫瘤中發揮著重要的生物學作用[3-5]。而既往研究發現，miR-655-3p在食管鱗狀細胞癌、宮頸癌、結直腸癌等多種腫瘤中表達水平降低，并具有重要的抑癌作用[6-8]。然而目前尚未發現miR-655-3p在頭頸鱗狀細胞癌中的相關研究，僅有一項研究發現miR-655-3p在口腔鱗狀細胞癌中表達降低，表現出一定程度的抑癌作用[9]。因此，為豐富和完善miRNA在頭頸鱗狀細胞癌中的相關研究，本研究進一步探討了miR-655-3p在頭頸鱗狀細胞癌中的表達情況及其臨床意義，對于深入探討頭頸鱗狀細胞癌相關機制研究具有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3月—2019年7月接受手術但術前均無放化療治療史的頭頸鱗狀細胞癌患者(耳鼻咽喉科、口腔科、頭頸外科)41例，其中男性37例，女性4例，年齡42～71歲，中位年齡57歲，有吸煙史33例，有飲酒史26例，低分化11例，中-高分化30例，伴有頸部淋巴結轉移24例，早期(Ⅰ～Ⅱ)頭頸鱗狀細胞癌患者13例，晚期(Ⅲ～Ⅳ)患者28例。樣本癌組織取自非壞死瘤體組織，癌旁正常組織取自距瘤體手術切緣3 mm(聲門型喉鱗狀細胞癌)、5 mm(其他部位頭頸鱗狀細胞癌)，各樣本組織類型均經術后病理證實。所有樣本均由河北大學附屬醫院耳鼻咽喉科負責收集并儲存于-80 ℃低溫冰箱(Haier，中國)。

本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法 所納入研究各組織樣本，總RNA提取及反轉錄均依照相應試劑盒說明書操作步驟完成。其中總RNA提取試劑盒(Promega，美國)用于各組織樣本中總RNA的提取，分光光度計(Thermo，美國)用于RNA濃度及純度檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳(含DEPC)法用于RNA完整性檢測。質控合格的各組織樣本總RNA，部分RNA樣本儲存于-80 ℃低溫冰箱，部分用于反轉錄。其中反轉錄試劑盒(Roche，德國)和普通PCR儀(BIO-RAD，美國)用于RNA反轉錄cDNA的合成，而cDNA濃度及純度通過分光光度計(Thermo，美國)檢測。

1.3miR-655-3p相對表達水平的檢測 基于所獲得組織樣本的cDNA，采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法，通過qRT-PCR 試劑盒(Promega，美國)和qRT-PCR儀(BIO-RAD，美國)檢測各樣本中miR-655-3p的相對表達水平。以U6作為內參照，以2-△△ct值代表各組織樣本中miR-655-3p相對表達量。相關miR-655-3p及內參U6引物參照既往研究[10]。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0 統計軟件分析數據。計量資料比較采用配對獨立樣本的t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1頭頸鱗狀細胞癌中miR-655-3p表達水平 通過qRT-PCR的方法進行相對表達水平檢測發現，在41對頭頸鱗狀細胞癌組織樣本中，有26對頭頸鱗狀細胞癌組織中miR-655-3p相對表達水平較配對癌旁正常組織降低(圖1)。表達水平總體分析發現，與配對癌旁正常組織中表達水平(4.849±2.485)相比，miR-655-3p在頭頸鱗狀細胞癌組織中表達水平明顯降低(4.475±2.168)，差異有統計學意義(t=2.217，P=0.032)。

圖1 頭頸鱗狀細胞癌組織中miR-655-3p表達水平分布情況

Figure 1 Expression of miR-655-3p in head and neck squamous cell carcinoma

2.2不同臨床特征的頭頸鱗狀細胞癌組織中miR-655-3p的表達情況 依據癌組織中miR-655-3p表達水平的中位數(4.565)，分為高表達組和低表達組。各組在不同性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒者之間構成比差異無統計學意義(P>0.05)。而低表達組晚期(Ⅲ～Ⅳ)構成為主(P=0.034)；2組在組織分化、頸部淋巴結轉移臨床特征組中，構成比不同，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征頭頸鱗狀細胞癌患者組織中miR-655-3p低表達率的比較Table 1 Comparison of miR-655-3p in different clinical features of head and neck squamous cell carcinoma (例數，%)

*采用連續校正卡方

3 討 論

作為生物學功能調控分子，miRNA是一類微小、非編碼RNA，長度約22個核苷酸大小，往往以經典的靶向結合方式在胞漿中發揮作用，通過其自身種子區與靶mRNA的3′-非翻譯區以堿基互補配對的方式結合，進而引起靶mRNA的翻譯抑制或降解，而某些成熟miRNA可以被轉運至細胞核內并在核內發揮某種生物學調控作用[11]。研究發現，miRNA在神經退行性相關疾病[12]、低氧誘導的心肌損傷[13]、腫瘤微環境[14]、癌細胞干性維持[15]、腫瘤表觀遺傳學調控[16]及腫瘤進展[17]等多種生物學過程中具有重要的生物學作用，包括抗癌治療相關研究[18]。隨著相關研究的逐步深入，miRNA在頭頸鱗狀細胞癌中的功能與作用機制研究同樣取得了一定的進展，其在頭頸鱗狀細胞癌中表達改變，從而參與了頭頸鱗狀細胞癌的發生發展，并與頭頸鱗狀細胞癌患者生存預后相關[19-20]。如有研究報道，miR-205-5p在頭頸鱗狀細胞癌中表達增高，并與患者無復發生存率相關，具有一定的臨床預后作用，相關機制研究提示其通過靶向抑制BRCA1 DNA repair associated和RAD17 checkpoint clamp loader component基因的表達，從而降低DNA損傷修復能力，并增加染色體不穩定，進而促進腫瘤的生長[21]。而miR-125a-5p作為腫瘤抑制因子，能夠通過靶向調控erb-b2受體酪氨酸激酶2 mRNA的表達，進而影響腫瘤細胞的增殖和對離子輻射的敏感性，其低表達水平與頭頸鱗狀細胞癌患者局部復發和不良預后有關[3]。另有研究發現，miR-4295在頭頸鱗狀細胞癌中表達增高，其表達與患者生存時間呈負相關，并能夠靶向抑制神經元正五聚蛋白1 mRNA的表達，進而促進頭頸鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移能力及上皮-間充質轉化進程，與腫瘤轉移相關[22]。有資料統計，全世界每年大約新增600 000例頭頸鱗狀細胞癌患者，同時有40%～50%的頭頸鱗狀細胞癌患者死亡，由于缺乏有效提高患者生存率及個性化的治療方案，其預后較差，因此，深入探究其發病機制，篩選特異性腫瘤標志物或靶向治療的新靶點，成為頭頸鱗狀細胞癌相關分子機制研究的重點[23]。為豐富和完善頭頸鱗狀細胞癌相關研究，本研究擬從miRNA這一重要的分子水平，探究頭頸鱗狀細胞癌中具有重要生物學作用的miRNA及其可能的發病機制?；诖搜芯磕康?，通過檢索miR-655-3p相關的既往研究，發現miR-655-3p作為抑癌因子，在食管鱗狀細胞癌患者血漿中表達水平降低，且其低表達水平與腫瘤細胞的淋巴管侵襲、淋巴結轉移及腫瘤分期相關，能夠抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力及上皮-間充質轉化進程，并與患者不良預后相關[6]。另有研究發現，miR-655-3p通過靶向抑制配對盒基因6 mRNA的表達，抑制ERK/p38 MAPK信號通路的活性，從而抑制視網膜母細胞瘤的惡性表型，如抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲能力，促進腫瘤細胞凋亡等[10]。Zhao等[24]報道，miR-655-3p在上皮源性卵巢癌中表達降低，通過靶向抑制血管內皮生長因子mRNA的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，進而抑制上皮源性卵巢癌的進展。MiR-655-3p在多種腫瘤中表現出不同程度的抑癌作用，提示雖然作用機制不同，但其生物學抑制作用具有泛癌性，可能在包括頭頸鱗狀細胞癌在內的其他多種腫瘤中具有類似的抑癌作用。而有關口腔鱗狀細胞癌的一項研究發現，miR-655-3p通過靶向作用于metadherin抑制PTEN/AKT信號通路，從而表現出抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲等抑癌功能[9]。基于以上既往研究的綜合分析，提示miR-655-3p作為重要的抑癌因子在多種腫瘤中表達下調，從而促進了腫瘤惡性表型的進展。因此，推測miR-655-3p可能在頭頸鱗狀細胞癌中同樣具有某種抑癌作用，呈低表達趨勢。本研究結果發現，miR-655-3p在頭頸鱗狀細胞癌中表達降低，且在不同臨床分期、組織分化程度及是否伴有頸部淋巴結轉移的組織樣本中表達水平存在差異。而miR-655-3p在具有不同臨床病理特征組織樣本中的差異表達，提示其在頭頸鱗狀細胞癌中具有潛在的臨床意義及可能的生物學作用。頭頸鱗狀細胞癌組織中miR-655-3p表達失活，從而誘導了癌的發生和進展，為靶向治療相關研究提供了一定的參考。

本研究首次探討了miR-655-3p在頭頸鱗狀細胞癌中的表達及其臨床相關性，對于深入研究頭頸鱗狀細胞癌的發病機制及其靶向治療具有重要意義。