不同處理方法對骨髓間充質干細胞與小腸黏膜下基質復合效果的影響

張 寧，秦錫靜，朱玉林，黃向華

(1.河北省石家莊市第四醫院生殖醫學中心，河北 石家莊 050011；2.湖南省常德市湘雅常德醫院婦產科，湖南 常德 415000；3.河北醫科大學第二醫院婦科，河北 石家莊 050000)

陰道重建術是解決無陰道患者性生活和性角色的主要方法。目前最常用的重建方法是在膀胱和直腸之間造穴并以各種不同組織襯里覆蓋創面重建陰道，組織襯里的選擇在很大程度上決定了手術效果。近年來隨著組織工程學的發展，組織工程襯里的構建為陰道重建提供了新的思路。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源充足，分離培養方法成熟，易于培養，有多向分化和旁分泌功能。小腸黏膜下基質(small intestinal submucosa，SIS)來源廣泛，制作方法相對簡單，含有多種生長因子[1]，已被用于多種組織工程，是一種比較理想的支架材料。已有研究證實，MSCs與SIS復合能促進創傷的修復[2]，重建食管能促進食管上皮化和肌肉再生[3]，與SIS復合后修補胃壁缺損能促進胃壁肌層的修復[4]，還可用于心血管重建[5]。研究顯示，MSCs復合SIS能促進大鼠重建陰道的修復[6-7]，但修復效果欠佳。本研究旨在優化MSCs與SIS的復合方法，改善大鼠重建陰道的修復效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 雄性Sprague-Dawley大鼠，2～5周，由河北醫科大學實驗動物中心提供[實驗動物質量合格證號1403076，許可證號 SCXY(冀) 2013-1-003]。DMEM/F12培養基(Hyclone)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)(Hyclone)，青霉素鈉(80萬U)和鏈霉素鈉(100萬U)(華北制藥)，胰蛋白酶溶液(0.25%Trypsin/1 mmol/L EDTA)(GIBICO)，L-谷氨酰胺(L-Glutamine)(Sangon)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma)。

1.2SIS的制備[8]取一段新鮮的豬小腸(空腸段尤宜)，用水反復沖洗，清除小腸內外壁黏附的物質，褪下漿膜和肌層沿小腸的縱軸翻轉剩余的小腸，使黏膜向外，用同樣的方法褪下黏膜，沿縱軸切開成片狀。用機械方法制得的SIS依次浸泡于含100 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH的溶液(pH 11～12)中16 h。含1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl的溶液(pH 0～1)中6～8 h，含1 mol/L NaCl和10 mmol/L PBS溶液中(pH 7～7.4)16 h，PBS溶液中2 h，含0.1%過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8 h殺菌。每次更換溶液均需用去離子水徹底沖洗干凈。長期儲存時先冷凍干燥，儲存于-80 ℃; γ射線照射，劑量25～35 kGy，使用前在室溫下用PBS溶液浸泡解凍。新鮮制備的、干燥后、復水后的SIS進行石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察。干燥的SIS行掃描電鏡觀察。

1.3大鼠MSCs的培養 大鼠頸椎脫臼處死后充分浸泡于75%酒精中5 min。仰臥位固定于手術臺上分離雙側脛骨、股骨，注意保持骨髓腔完整。放在盛有PBS清洗液的60 mm玻璃培養皿中，移入超凈臺。用PBS清洗液充分清洗數次，10 mL 75%酒精浸泡5 min，移入另一個干凈培養皿中，PBS清洗液充分清洗數次。剪去2側骨骺端，移入另一個盛有DMEM/F12培養基的培養皿中，用DMEM/F12 培養基沖洗骨髓腔。以上操作均在冰上進行。獲得的細胞懸液移入離心管1 000 r/min離心5 min。棄上清，3 mL DMEM/F12 完全培養基重懸，70 μm細胞篩過濾細胞懸液，接種于25 cm2細胞培養瓶中，補充培養液至5 mL，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度細胞培養箱中培養。72 h首次換液，之后隔日換液1次。待細胞70%～80%融合時用胰蛋白酶溶液傳代。此為第1代細胞，4～6 d即可融合，第3代細胞用于后續實驗。

1.4大鼠MSCs與SIS復合條件的篩選

1.4.1大鼠MSCs與SIS復合濃度及復合時間對復合效果的影響 將SIS按96孔板培養孔大小剪成圓形,盡量適形后黏膜面朝上置于孔底，加DMEM/F12完全培養基置恒溫箱內預濕24 h待用。第3代MSCs消化重懸于DMEM/F12完全培養基中，調整細胞濃度為4×106/mL、2×106/mL、1×106/mL。分別接種于96孔板中的預濕后小腸黏膜下層上，每孔100 μL(每個濃度12個孔)。24 h后首次換液，此后隔日換液1次。分別于復合后1,3,5,7 d取3孔用MTT法檢測細胞活性。

1.4.2大鼠MSCs與SIS復合次數對復合效果的影響 第3代MSCs消化，重懸于DMEM/F12完全培養基中，調整細胞濃度為4×106/mL、2×106/mL、1×106/mL，分別接種于96孔板中的預濕后小腸黏膜下層上，每孔100 μL(4×106/mL 12個孔，2×106/mL，1×106/mL每個濃度21個孔)。24 h后首次換液，此后隔日換液1次。復合后第2天2×106/mL，1×106/mL濃度中的9個孔以相同細胞濃度重復接種1次，分別于復合后1,3,5,7d取3孔用MTT法檢測細胞活性。

1.4.3SIS的預處理方法對復合效果的影響 將SIS按96孔板培養孔大小剪成圓形,盡量適形后黏膜面朝上置于孔底。新法：預濕24 h后吸凈培養基使SIS貼附與培養孔底，盡量排凈SIS與培養孔底之間的氣泡，將培養板置于超凈臺中靜置30 min，待SIS干燥，完全貼附于培養孔底部后再次加入DMEM/F12完全培養基預濕24～48 h待用。舊法：加DMEM/F12完全培養基置恒溫箱內預濕24 h待用。第3代MSCs融合達90%后，消化重懸于DMEM/F12完全培養基中，調整細胞濃度為4×106/mL、2×106/mL。分別接種于96孔板中的預濕后小腸黏膜下層上，每孔100 μL(每個濃度，每種預濕方法3個孔)。24 h后用MTT法檢測細胞活性。

1.5光學顯微鏡 掃描電鏡觀察復合情況。

1.6統計學方法 應用SPSS 16.0 統計軟件處理數據。計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1SIS大體及鏡下觀察 新鮮制備的SIS為乳白色，HE染色鏡下見疏松的膠原組織，無細胞殘留(圖1A)。冷凍干燥后的SIS呈淡黃色薄膜狀，HE染色鏡下見膠原組織結構變致密，膠原組織間無明顯空隙(圖1B)，厚度為(6.80±1.10) μm。復水后膠原組織再次呈現疏松結構(圖1C)，厚度為(25.79±11.00) μm。掃描電鏡觀察見SIS漿膜面光滑，黏膜面粗糙(圖2 A,B)。

圖1新鮮(A)，冷凍干燥(B)和復水后(C) SIS(HE ×200)

圖2 掃描電鏡下觀察SIS(×1 000)

A.漿膜面；B.黏膜面

2.2不同方法對復合效果的影響

2.2.1大鼠MSCs與SIS復合濃度及復合時間對復合效果的影響 4×106/mL MSCs與SIS復合后第1天黏附率較低，復合后3 d最高，以后逐漸降低。2×106/mL MSCs與SIS復合后第1天黏附率最高，以后逐漸降低。1×106/mL MSCs與SIS復合后黏附率先下降，第5天有所回升，其后又降低(圖3)。

2.2.2大鼠MSCs與SIS復合次數對復合效果的影響 復合后同一時間，4×106/mL MSCs與SIS復合后的黏附率不及2×106/mL MSCs與SIS分2次復合后的黏附率，2×106/mL MSCs與SIS復合后的黏附率不及1×106/mL MSCs與SIS分2次復合后的黏附率。但2次復合后的黏附率并不比高濃度單次復合后1 d的黏附率高。隨時間延長各組的黏附率均降低(圖4)。

2.2.3SIS的預處理方法對復合效果的影響 2×106/mL MSCs與新法預處理的SIS復合后其黏附率高于舊法，差異有統計學意義(P<0.05)。4×106/mL MSCs新法與舊法預處理的SIS復合后其黏附率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖5。

圖3 細胞濃度和復合時間對復合效果的影響

圖4 細胞濃度和復合次數對復合效果的影響

方法4×1062×106新法1.306±0.1292.013±0.049 舊法1.415±0.0581.684±0.156 t值1.3383.481P值0.2520.025

圖5 復合MSCs后的SIS

A.標尺=100 μm ；B.標尺=25 μm

3 討 論

先天畸形及后天疾病均可導致陰道缺失，給患者帶來軀體的痛苦和巨大的精神心理壓力，嚴重影響生活質量，因此重建一個結構和功能均接近生理狀態的陰道顯得尤為重要。目前最常用的重建方法是在膀胱和直腸之間造穴，并以各種不同的組織襯里覆蓋創面重建陰道，組織襯里的選擇在很大程度上決定了手術效果，常用的組織襯里有腹膜、皮片、皮瓣、腔黏膜、頭皮等自體組織及羊膜、胎兒皮膚等異體組織，自體組織重建陰道給患者帶來新的創傷且存在自體取材受限的問題，異體組織又可能感染外源性疾病，均非理想的組織襯里材料，近年來隨著組織工程學的發展為陰道重建提供了新思路。Zhu等[9]用脫細胞真皮基質，Ding等[10]用小腸黏膜下基質作為襯里施行陰道重建術均獲得了比較滿意的結果，但是單純應用支架組織仍有一定的弊端，如術后陰道黏膜鱗化速度較慢使患者開始性生活的時間較長等[11]。種子細胞與支架材料復合能促進重建陰道各種組織成分的再生，可能構建一個更接近生理狀態的陰道。

SIS主要由豬的小腸制備，含有多種因子，如成纖維細胞生長因子,血管內皮生長因子和轉化生長因子β等[1]，能促進組織的修復，相容性好[12]，利于細胞的附著和生長，使其成為組織工程支架的最佳選擇，已經應用于多種組織的重建。本研究采用Abraham等[8]的方法制備SIS，HE染色后未發現有細胞殘留，MSCs在制備SIS上生長狀態良好，掃描電鏡下可見細胞附著在SIS表面，呈長梭形或不規則形狀。

目前用于陰道重建的種子細胞主要有陰道上皮細胞、頰黏膜上皮細胞、陰道平滑肌細胞[13-14]。雖然復合這些細胞可以促進陰道上皮和肌層再生，但是上皮細胞、平滑肌細胞培養條件苛刻，不利于大量培養和臨床應用。MSCs來源充足，分離培養方法成熟，易于培養，且有多向分化能力。最近研究發現，干細胞可向神經細胞分化[15]，有利于神經再生，非常適合作為種子細胞與SIS復合后重建陰道。

前期研究顯示，MSCs復合SIS能促進重建陰道的修復[6-7]，但修復效果不甚理想。局部干細胞的數量可能影響治療效果，復合條件的篩選尤為重要。MSCs與SIS復合情況主要與MSCs的復合濃度、復合時間、復合次數及SIS的預處理方法有關。關于接種密度和復合時間各文獻報道不一，細胞接種密度從2×105個/cm2[16]，5×105個/cm2[2]，8×105個/cm2[17]、1×106個/cm2[18]均有報道。復合時間有24 h者[19]、48 h者[16]，也有復合5 d[19]、1周[17]者。為了確定合理的接種密度和復合時間，本研究采用MTT法檢測了不同密度和不同復合時間后的吸光度，結果顯示，2×105個/孔(約5×105個/cm2)最適合細胞黏附。細胞密度過大可能影響細胞展開黏附，或營養不足影響細胞活性和黏附率。細胞密度過小雖能保證黏附但總的細胞附著數量有限。本研究還比較了復合次數對復合情況的影響，分2次復合并不比單次復合后1 d的附著率高，因此最終確定以2×105個/孔復合1 d效果最佳。由于SIS在培養基中復水后漂浮于培養基中，細胞接種后不能有效地覆蓋于SIS上，將SIS在培養基中復水24 h后吸凈培養基排除SIS與培養孔底之間的氣泡，使SIS完全貼附于培養孔底部，靜置干燥后SIS于培養孔底黏附較緊，再次添加培養基復水后仍能黏附于孔底，使細胞能有效地覆蓋于SIS上，利于細胞附著。2×105個/孔的MSCs與經過處理后的SIS復合時黏附率高于單純預濕的SIS。4×105個/孔的MSCs與經過處理后的SIS復合時黏附率低于單純預濕的SIS，進一步證實過高濃度不利于細胞附著。

本研究探討了MSCs與SIS最佳的復合方法，最終確定采用新的預濕方法，以2×106/mL的濃度與SIS復合1 d后用于移植，為后續的研究奠定了基礎。