丹參酮IIA調控孕烷X受體的轉錄因子活性誘導肝細胞癌細胞對分子靶向藥物索拉非尼耐受

唐滋貴， 趙松峰， 王艷麗*

(1.河南醫學高等專科學校，鄭州 451191；2.鄭州大學第一附屬醫院藥學部，鄭州 450052)

目前，中國肝細胞癌(HCC)最為主要的危險因素(流行病學特征)是以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為代表的各種肝炎病毒[1-2]。HBV等肝炎病毒能夠造成患者的多種急性/慢性肝病，盡管現有抗病毒治療-對癥治療策略取得了諸多進展，但仍有相當部分患者疾病會發生進展，最終罹患肝細胞癌[1-2]。Polaris[3]在Lancet Gastroenterol Hepatol撰文系統總結了HBV相關流行病學資料：目前中國(包括港澳臺地區)有超過8 000萬人感染HBV或患有HBV相關的各種慢性肝病，這使得HCC不僅嚴重影像患者身體健康，也是中國公共衛生系統的巨大挑戰。現有HCC抗腫瘤藥物治療策略主要是以索拉非尼(Sorafenib)為代表的各類分子靶向藥物(即各種口服小分子蛋白激酶抑制劑)[4]，這些藥物不僅治療費用極為昂貴，也存在嚴重的耐藥現象[5]。因此，探索HCC分子靶向藥物耐藥的分子機制不僅有重大的理論意義，也有助于研究和開發更為有效的HCC分子靶向治療策略。

孕烷X受體(PXR)是一類重要的核受體，是細胞對外源性藥物、毒物代謝與清除的調控樞紐[6]。Feng等[7]的研究顯示，分子靶向藥物索拉非尼能夠作為配體或激動劑(ligand/angonist)誘導PXR的活性進而上調PXR下游耐藥相關基因MDR-1以及CYP3A4的表達，最終以類似“負反饋調節”的方式最終造成HCC對其自身的耐藥作用。因此，PXR是HCC分子靶向治療耐藥的重要調控樞紐[7-8]。丹參酮IIA(Tanshinone ⅡA)是丹參等重要提取所得的活性物質，被廣泛應用于冠心病等心腦血管病疾病的輔助治療等[9-11]。丹參酮IIA的抗腫瘤作用也多有報道，Chiu等[12]、Ren等[13]以及Lin等[14]表明，丹參酮IIA具有對HCC細胞的抗腫瘤活性。本研究檢測了Tanshinone ⅡA對HCC細胞PXR活性的影響，發現丹參酮IIA能夠調控孕烷X受體的轉錄因子活性誘導肝細胞癌細胞對索拉非尼耐受。

1 實驗材料與儀器

抗腫瘤藥物與試劑盒：丹參酮IIA單體購買自美國MCE公司(產品編號為HY-N0135)；分子靶向藥物索拉非尼(產品編號為S7397)、瑞戈非尼(Regorafenib/BAY 73-4506)(產品編號為S1178)、侖伐替尼(Lenvatinib/E7080)(產品編號S1164)、阿帕替尼(Apatinib)(產品編號S5248)以及安羅替尼(Anlotinib/AL3818)(產品編號為S8726)購買自美國Selleck公司；蛋白印跡實驗使用的抗體包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的抗體(產品編號為ab3366)、CYP3A4的抗體(產品編號為ab3572)等購買自美國Abcam公司；分子生物學研究使用的表達載體包括熒光素酶報告基因XREM-Luc、PXRE-Luc、DR3-Luc以及ER6等，PXR的表達載體以及干擾載體為中國人民解放軍第三〇二醫院馮帆博士惠賜[7,15]；定量PCR實驗(qPCR)使用的RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及定量PCR試劑盒均購買自美國ABI公司；細胞MTT實驗使用的試劑盒購買自美國Amerresco公司；藥物代謝與清除相關生化試劑如乙腈等購買自國藥集團。

細胞系與細胞培養相關試劑：HEK293細胞、高侵性的HCC細胞MHCC97-H為本實驗室保存；細胞培養使用的DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等購買自美國Thermo公司；培養細胞使用的細胞培養板購買自美國Corning公司；轉染試劑脂質體購買自美國Invitrogen公司；含有PXR干擾載體的慢病毒顆粒購買自濟南Vigene公司。

實驗動物與動物實驗器材：研究使用的胸腺缺失的裸鼠(Bal B/c品系)購買自北京斯貝福生物科技有限公司；動物實驗使用的吸入麻醉機異氟烷、動物手術的器械、動物手術相關耗材(包括注射器、縫合針線、棉簽、碘酒以及粘鼠板)等由本實驗室保存。

實驗涉及的儀器：分子生物學實驗相關設備[DNA電泳儀(ABI公司)、PCR儀(ABI公司)、qPCR儀(ABI公司)]、蛋白印跡實驗相關設備[SDS-PAGE電泳儀(BioRad公司)、轉膜儀(BioRad公司)]、細胞培養實驗相關設備[細胞培養箱(Thermo公司)、倒置顯微鏡(尼康公司)]、動物實驗相關設備[吸入麻醉機(北京六一設備廠)、多功能酶標儀(Thermo公司)]等均由本實驗室保存。

2 實驗方法

2.1 藥物配制

使用精密天平稱取抗腫瘤藥物純品粉末，以DMSO溶解配置為藥物母液，使用含有0.5%FBS的DMEM對藥物母液進行稀釋，配置系列濃度梯度(10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 μmol/L)的抗腫瘤藥物工作液(DMSO終濃度為1‰左右)。

2.2 細胞培養與MTT實驗

使用含有10% FBS的DMEM培養HCC細胞，待細胞狀態良好時，使用胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，再將細胞懸液接種96孔細胞培養板中，每孔接種細胞8 000個，待細胞充分貼壁后以藥物工作液處理細胞48 h后，按廠商說明書進行MTT實驗，以490 nm波長處的吸光度值(O.D.)反映出細胞的數量。以1‰ DMSO為溶液對照，藥物作用于細胞的抑制率的計算公式為

抑制率=

(1)

對于細胞實驗，使用脂質體按照廠商說明書在HCC細胞中轉染相應質粒；對于動物實驗，MHCC97-H細胞中感染慢病毒顆粒，進行篩選獲得穩定克隆后可進行動物實驗。

2.3 定量PCR實驗

用系列濃度梯度的丹參酮IIA處理MHCC97-H細胞24 h后，依據廠商說明書提取總RNA樣品，對樣品進行反轉錄，再進行定量PCR實驗。目的基因的表達前度檢測方法為SYBR Green染色2-△△CT法，以內參基因β-Actin為參比，依據定量PCR實驗中各目標基因的相對表達水平。各基因定量PCR實驗檢測使用的引物如表1所示。

表1 qPCR (Real-time PCR)實驗引物Table 1 Primers used in qPCR (Real-time PCR) experiments

2.4 蛋白印跡檢測實驗

用系列濃度梯度的丹參酮IIA處理MHCC97-H細胞48 h后，收集細胞，使用SDS-PAGE上樣緩沖液混合細胞后以沸水浴15～20 min進行裂解，之后在12 000 r/min離心20～30 min，收集上清即為細胞中總蛋白樣品。對樣品進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠為5%，分離膠為12.5%)后，將凝膠中的蛋白樣品轉印到PVDF膜上；使用15%的脫脂奶粉TBST溶液進行封閉，再使用抗體進行孵育。一抗(primary antibodies)的稀釋倍數為P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的抗體(1∶1 000)、CYP3A4的抗體(1∶5 000)、內參β-Actin(1∶5 000)；再孵育二抗(Secondary antibody)，化學發光法顯色。

2.5 HCC裸鼠成瘤實驗

對于皮下腫瘤模型，培養獲得MHCC97-H細胞，利用生理鹽水制備細胞懸液，將細胞懸液接種于裸鼠皮下，獲得MHCC97-H細胞的皮下腫瘤組織。對于肝臟原位腫瘤組織，預先制備MHCC97-H細胞的腫瘤皮下腫瘤，再將皮下腫瘤組織制備為組織微塊備用。以吸入麻醉的方式將裸鼠麻醉，再進行開腹手術將前述獲得的組織微塊接種裸鼠肝臟原位以形成裸鼠HCC的肝臟原位腫瘤模型。通過精密天平的稱量保證組織微塊質量的均一與一致。在前述基礎上進行灌胃給藥，動物給予溶液對照(生理鹽水)、系列濃度梯度的丹參酮IIA、分子靶向藥物索拉非尼進行治療。動物每兩天灌胃給藥一次，待灌胃治療約10次(即治療3周左右)后，收集動物獲取皮下腫瘤組織或形成腫瘤組織的肝臟臟器。對于皮下腫瘤，使用天平稱重或計算腫瘤質量。皮下腫瘤體積計算公式為

腫瘤體積=腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2

(2)

使用圖像分析軟件Image J，按照Chen等[16]的方法進行定量分析，確定腫瘤病灶的總面積。

2.6 索拉非尼在HCC細胞中的代謝與清除檢測

按照Wu等[17]和Chen等[18]的方法配置分子靶向藥物索拉非尼的藥物溶液，對于細胞實驗，使用含有索拉非尼的培養孵育HCC細胞12 h后，換正常培養基孵育細胞，在系列時間點收集細胞樣品；對于動物實驗,在HCC皮下腫瘤組織中注射索拉非尼的溶液后，動物口服給予溶液對照或丹參酮IIA，在系列時間點收集腫瘤組織。使用超聲破碎細胞養品、使用液氮研磨破碎腫瘤組織樣品，再以有機溶劑乙腈萃取樣品中的藥物，按照Wu等[17]和Chen等[18]的方法進行液相色譜-質譜聯用檢測(LC-MS/MS)檢測，確定索拉非尼在HCC細胞及腫瘤組織中的代謝與清除情況。

2.7 統計學分析

結果顯示為均值±標準差以表明生物學重復和結果偏差；使用SPSS 17.0版本的統計分析軟件進行t-檢驗或單因素方差分析；使用Origin 8.0版本軟件計算藥物作用的半數作用濃度以及藥物代謝與清除的半衰期；P<0.05顯示組間差異具有統計學顯著性。

3 研究結果

(1)丹參酮IIA能夠劑量依賴地誘導PXR的轉錄因子活性，結果如表2所示，丹參酮IIA處理HCC細胞，能夠劑量依賴地上調PXR轉錄因子活性報告基因XREM-Luc、PXRE-Luc、DR3-Luc以及ER6-Luc的活性。進一步檢測了PXR下游耐藥相關基因MDR-1和CYP3A4的mRNA與蛋白表達水平。結果如圖1和圖2所示，丹參酮IIA能夠劑量依賴地誘導PXR下游基因MDR-1、CYP3A4的mRNA表達水平(圖1)；誘導MDR-1、CYP3A4的蛋白表達水平(圖2)。

(2)丹參酮IIA能夠誘導細胞對分子靶向藥物索拉非尼的耐受。首先確定了丹參酮IIA的作用濃度，結果如圖3所示，丹參酮IIA能夠劑量依賴地殺傷HCC細胞系，其中30 μmol/L以及10 μmol/L劑量的丹參酮IIA具有一定的抗腫瘤作用；為此結合前述結果(圖1、圖2)，選取3 μmol/L劑量(該劑量下，丹參酮IIA自身無顯著細胞毒性，并能夠顯著誘導PXR下游基因MDR-1、CYP3A4的表達水平)進行進一步實驗。進一步結果顯示(表3)，3 μmol/L劑量的丹參酮IIA處理HCC細胞能夠上調索拉非尼作用于HCC細胞的半數抑制濃度(IC50)誘導細胞對索拉非尼的耐受。除分子靶向藥物索拉非尼外，3 μmol/L劑量的丹參酮IIA也能夠誘導HCC細胞對其他分子靶向藥物，如瑞戈非尼、阿帕替尼、安羅替尼以及侖伐替尼等的耐受作用。

表2 丹參酮IIA對PXR轉錄因子活性的EC50Table 2 The EC50 values of tanshinone IIA on PXR’s transcription factor activation

用一定濃度丹參酮IIA處理MHCC97-H細胞24 h。然后，收集細胞進行qPCR實驗。MDR-1或CYP3A4 mRNA水平為平均值±SD。丹參酮IIA治療組與溶液對照組比較，*P<0.05圖1 丹參酮IIA誘導兩種PXR下游基因的mRNA水平Fig.1 Tanshinone IIA induced the mRNA level of two PXR’s downstream genes

用一定濃度丹參酮IIA處理MHCC97-H細胞24 h。然后，收集細胞進行western blot實驗。用抗體檢測P-gp或CYP3A4蛋白水平，并進行比較。β-Actin被選作內參(參比)圖2 丹參酮IIA誘導兩種PXR下游基因的蛋白表達Fig.2 Tanshinone IIA induced the protein level of two PXR’s downstream genes

用一定濃度丹參酮IIA處理MHCC97-H細胞48 h。然后，收集細胞進行MTT實驗。丹參酮IIA對MHCC97-H細胞存活率的影響以通過O.D. 490nm算得抑制率的平均值±SD表示。丹參酮IIA治療組與溶液對照組比較，*P<0.05圖3 丹參酮IIA抑制MHCC97-H細胞存活Fig.3 Tanshinone IIA inhibited the survival of MHCC97-H cells

表3 丹參酮IIA誘導MHCC97-H細胞對分子靶向藥物耐受Table 3 Tanshinone IIA induced the resistance of MHCC97-H cells to molecular targeted agents

將MHCC97-H細胞注射入裸鼠體內形成皮下腫瘤，口服丹參酮IIA給藥，收集腫瘤，結果顯示腫瘤組織照片、腫瘤體積或腫瘤質量，*P<0.05圖4 丹參酮IIA抑制MHCC97-H細胞皮下成瘤Fig.4 Tanshinone IIA inhibited the subcutaneous growth of MHCC97-H cells

將MHCC97-H細胞注射入裸鼠體內形成皮下腫瘤，口服丹參酮IIA給藥，收集腫瘤進行qPCR實驗。MDR-1或CYP3A4 mRNA水平為平均值±SD。丹參酮IIA治療組與溶液對照組比較，*P<0.05圖5 丹參酮IIA誘導皮下腫瘤中MDR-1或CYP3A4表達Fig.5 Tanshinone IIA induced the mRNA level of MDR-1 or CYP3A4 in subcutaneous tumors

進一步在裸鼠成瘤模型中檢測了丹參酮IIA對分子靶向藥物殺傷HCC細胞的影響。使用MHCC97-H細胞系接種裸鼠皮下部位(Subcutaneous position)形成皮下腫瘤，給予裸鼠系列濃度梯度的丹參酮IIA，結果如圖4所示，僅有較高劑量的丹參酮IIA(10 mg/kg以及5 mg/kg)具有一定的抗腫瘤活性，而較低劑量的丹參酮IIA(1 mg/kg以及2 mg/kg)即能夠誘導腫瘤組織中耐藥基因MDR-1以及CYP3A4的表達(圖5)，為此選取較低劑量的丹參酮IIA(2 mg/kg劑量，即其自身無明顯細胞毒性即能夠誘導耐藥基因表達)進行后續實驗。在此基礎上，2 mg/kg劑量的丹參酮IIA能夠下調分子靶向藥物索拉非尼對MHCC97-H細胞在裸鼠中的皮下成瘤(圖6)以及肝臟原位成瘤(圖7)作用，上調MHCC97-H細胞對索拉非尼的耐受作用。

將轉染對照siRNA或PXR siRNA (siPXR)的MHCC97-H細胞注入裸鼠體內，形成皮下腫瘤，口服丹參酮IIA(2 mg/kg)、索拉非尼(2 mg/kg)或丹參酮IIA (2 mg/kg) +索拉非尼(2 mg/kg)，收集皮下腫瘤組織，結果顯示為腫瘤組織照片、腫瘤體積或腫瘤質量，*P<0.05圖6 丹參酮IIA抑制索拉非尼的抗腫瘤作用Fig.6 Tanshinone IIA decreased the antitumor effect of sorafenib

將轉染對照或PXR siRNA (siPXR)的MHCC97-H細胞注射至腫瘤裸鼠肝臟原位，口服丹參酮IIA (2 mg/kg)、索拉非尼(2 mg/kg)或丹參酮IIA (2 mg/kg) +索拉非尼(2 mg/kg)，收集有腫瘤組織的裸鼠肝臟臟器，結果顯示為肝臟臟器照片、腫瘤病灶的相對面積，*P<0.05圖7 丹參酮IIA降低索拉非尼對MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟原位生長的抗腫瘤作用Fig.7 Tanshinone IIA decreased the antitumor effect of sorafenib on the intahepatic growth of MHCC97-H cells

(3)丹參酮IIA誘導細胞對索拉非尼耐受的機制研究。首先確定了丹參酮IIA誘導耐藥基因表達的特異性，結果如圖8所示，丹參酮IIA誘導CYP3A4的mRNA、蛋白表達是依賴于PXR的(圖8)：使用PXR的小干擾RNA(PXR的siRNA)在HCC細胞中敲低PXR的表達，此時丹參酮IIA不再能誘導PXR下游耐藥相關基因的表達作用；在此基礎上，檢測了丹參酮IIA誘導HCC細胞對分子靶向藥物耐受的特異性，結果如表4所示，在HCC細胞中轉染PXR的干擾載體能夠阻斷丹參酮IIA誘導HCC細胞對分子靶向藥物的耐受作用；丹參酮IIA單獨作用不能影響索拉非尼對HEK293細胞的殺傷作用，而在HEK293細胞中轉染PXR的表達載體后再使用丹參酮IIA處理細胞，此時丹參酮IIA能夠誘導細胞對索拉非尼的耐受作用(表4)。

單純檢測丹參酮IIA誘導耐藥相關基因的表達不能充分反映出丹參酮IIA的作用機制，進一步檢測了索拉非尼在HCC細胞中的代謝與清除作用，結果如表5所示。丹參酮IIA處理HCC細胞能夠加速分子靶向藥物在HCC細胞中的代謝與清除作用，縮短索拉非尼在HCC細胞中的半衰期；在腫瘤組織中注射索拉非尼溶液后，再對動物灌胃給予丹參酮IIA能夠加速分子靶向藥物在HCC腫瘤組織中的代謝與清除作用，縮短索拉非尼在HCC腫瘤組織中的半衰期(表5)。這表明，丹參酮IIA能夠通過誘導PXR的轉錄因子活性誘導PXR下游耐藥相關基因的表達，最終通過加速索拉非尼在HCC細胞中的代謝與清除作用造成HCC細胞對索拉非尼的耐藥。

用對照或PXR siRNA (siPXR)轉染MHCC97-H細胞，然后，用10 μmol/L利福平(用作陽性對照)或10 μmol/L丹參酮IIA處理細胞，收集細胞進行western blot實驗。用抗體檢測CYP3A4或P-gp蛋白水平，并進行檢測。β-Actin被選為內參(參比)圖8 丹參酮IIA通過PXR誘導P-gp或CYP3A4表達Fig.8 Tanshinone IIA indcued the expression of P-gp or CYP3A4 via PXR

表4 丹參酮IIA通過PXR誘導MHCC97-H細胞對索拉非耐受Table 4 Tanshinone IIA induced the resistance of MHCC97-H cells to Sorafenib via PXR

表5 丹參酮IIA通過PXR促進MHCC97-H細胞中索拉非尼的清除Table 5 Tanshinone IIA accelerated the clearance of Sorafenib in MHCC97-H cells via PXR

4 討論

受到臨床診療現狀等的限制，目前大多數HCC患者初診即為進展期(Advanced HCC)，總體愈后很差[19]。分子靶向藥物是進展期HCC的主要治療策略，但索拉非尼已在臨床廣泛應用，其治療效果不能令人滿意存在明確的藥物耐受[5]。因此，闡明分子靶向藥物耐藥的分子機制具有重要意義。早期的研究主要關注于PXR在藥物代謝等領域的功能與調控機制，最近的研究表明PXR能夠作為HCC細胞對分子靶向藥物耐藥的調控樞紐[6]。誘導PXR的轉錄因子活性能夠上調MDR-1等耐藥基因的表達，最終造成藥物耐受。本研究使用高侵襲性的MHCC97-H細胞為研究模型以更好地模擬進展期HCC，丹參酮IIA能夠誘導PXR的轉錄因子活性，實現HCC細胞對分子靶向藥物的耐受作用。較高劑量的丹參酮IIA具有一定的抗腫瘤活性，但不具備抗腫瘤活性劑量的丹參酮IIA即能夠誘導PXR的轉錄因子活性。丹參酮IIA多種是心腦血管疾病的常用輔助治療藥物，研究的結果不僅有助于拓展對丹參酮IIA參與調控的藥物相互作用的認識，也增進了對丹參酮IIA調節HCC分子靶向治療耐受的認識。

另一方面，肝臟是人體對內源性/外源性有毒/有害物質代謝與清除的主要臟器，HCC作為肝細胞來源的惡性腫瘤，HCC細胞能夠通過對索拉非尼等藥物的代謝與清除作用保護自身免遭藥物的殺傷，最終造成藥物耐受。PXR下游耐藥基因相關基因，在藥物代謝研究領域是藥物代謝酶類，如CYP3A4是I相代謝酶，而MDR-1編碼的P糖蛋白是III相代謝酶[5,8]；這些基因在抗腫瘤耐藥等研究領域則能夠作為各種耐藥基因誘導抗腫瘤藥物耐藥。本研究的結果不僅檢測了丹參酮IIA誘導這些耐藥基因的表達，還利用檢測了丹參酮IIA對索拉非尼在HCC細胞以及腫瘤組織中半衰期的影響。未來將建立其他分子靶向藥物的LC-MS/MS方法學體系，確定丹參酮IIA是否能夠加速其他分子靶向藥物在HCC細胞或腫瘤組織中的代謝與清除作用。

現已證實，進展期HCC具有對細胞毒性化療藥物多藥耐藥(MDR)的特性，因此分子靶向治療對進展期HCC抗腫瘤藥物治療具有重要意義。早期，進展期HCC分子靶向治療藥物僅有索拉非尼一種。最近，侖伐替尼被批準上市成為I線治療藥物[20]、瑞戈非尼[4]被批準上市作為II線治療藥物進入進展期HCC臨床診療。這些藥物應用時間較短，隨著時間推移也可能會有耐藥的報道。上述3種藥物都是國外廠商研發的。除此之外，中國廠商也研發出了同類藥物，例如江蘇恒瑞醫藥股份有限公司的阿帕替尼已有對HCC抗腫瘤治療的報道[21-22]，江蘇正大天晴公司的安羅替尼作用機制與上述藥物類似[23]，未來也有希望應用于HCC臨床治療。為此，本研究也選取了阿帕替尼和安羅替尼等進行了檢測，不僅有助于深入了解這兩種藥物的抗腫瘤作用，也有助于研究和開發具有自主知識產權的藥物。

5 結論

(1)丹參酮IIA能夠劑量依賴地誘導PXR的轉錄因子活性。

(2)丹參酮IIA能夠誘導細胞對分子靶向藥物索拉非尼的耐受。

(3)丹參酮IIA調控孕烷X受體的轉錄因子活性誘導肝細胞癌細胞對索拉非尼耐受。