氣質聯用法(GC-MS)檢測禾谷鐮刀菌代謝指紋分析

項 萍，唐 喆

(西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100)

小麥赤霉病是世界范圍內流行性病害，會導致糧食減產和品質下降。染病作物產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(即嘔吐毒素DON)對人畜有很大的毒害作用，直接對人畜健康和生命安全構成威脅[1-2]。禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)是小麥赤霉病的主要致病菌[3-4]，科學家們對禾谷鐮刀菌的生長習性、毒素分泌、致病機理、侵染小麥的機理等多個方面進行研究，以期通過生物學方法解決赤霉病害。近年來，代謝組學[5]概念的提出為研究者提供了新的思路，代謝組學主要研究生物體對病理生理刺激或基因修飾所產生代謝物的質和量的動態變化規律。這種整體研究模式可以全面了解代謝物質在疾病發生、發展過程中的變化規律，利用代謝組學分析手段研究真菌基因功能可以豐富真菌基因鑒定的手段，進一步了解抗病機制，最終達到防治病害的目的[6]。

代謝指紋分析(Metabolite fingerprinting analysis)[7-9]是代謝組學研究的方法之一，主要是運用某一種或多種不同的分析手段對細胞內大量代謝物進行掃描分析。代謝指紋分析常用的分析手段有核磁共振(NMR)、傅氏變換紅外光譜(FT-IR)以及與MS相聯用的氣相色譜質譜聯用(GC-MS)、液相色譜質譜聯用(LC-MS)、高效液相色譜質譜聯用(UPLC-MS)等[10]，其中GC-MS可用于分析揮發性的有機物以及衍生化以后具有揮發性的初級代謝物[11]，并且基于GC-MS具有廣泛成熟的數據庫便于檢索確定物質組成。本研究建立了GC-MS檢測分析禾谷鐮刀菌代謝產物方法，采用2種衍生化方法進行檢測，并對代謝產物指紋圖譜進行分析，為禾谷鐮刀菌致病機理研究提供參考，為真菌類物質的代謝組學分析提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010氣相色譜-質譜儀(Aoc-20i自動進樣器、色譜柱型號(Rxi-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm，島津公司)，SOH-72E高溫分解干燥箱(Smart lab公司)，Sep-Pak C18固相萃取柱(6 mL 500 mg，Waters公司)，GY-DCY-24S氮吹儀(海歸永電子有限公司)，Vortex-Genie2渦旋震蕩器(Scientific Industries公司)，0.45 μm玻璃纖維濾膜(美國PALL公司)。

吡啶(色譜純，Sigma公司)、氯甲酸甲酯(MCF)(分析純Sigma公司)、三甲基硅烷咪唑(TMSI)(分析純，Fluka公司)、三甲基氯硅烷(TMCS)(色譜純，Sigma公司)、異辛烷(色譜純，Merck公司)、氯仿(色譜純，Sigma公司)其他試劑均為國產分析純試劑，購于天津富宇精細化工有限公司。

1.2 菌株

禾谷鐮刀菌野生型PH-1菌株，由西北農林科技大學許金榮實驗室保存。

MM培養基：NaNO3(2 g)、 KH2PO4(1 g)、KCl (0.5 g)、MgSO4·7H2O (0.5 g)、蔗糖 (30 g)、FeSO4·7H2O (10 mg)、瓊脂(15 g)，加水定容至1 L，調整pH為5.6，121 ℃，滅菌15 min；CM培養基：葡萄糖(10 g)、絡蛋白氨基酸(1 g)、酵母提取物(1 g)、蛋白胨(2 g)、NaNO3(6 g)、MgSO4·7H2O(1.023 g)、KH2PO4(1.5 g)、KCl(0.5 g)、瓊脂(15 g)加水定容至1 L，調整pH為6.5，121 ℃，滅菌15 min。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 菌絲樣品的制備 將-80 ℃保存的禾谷鐮刀菌野生型PH-1菌株活化于小皿上，25 ℃培養4 d；然后用直徑1 cm打孔器打孔得到菌餅，接種5個菌餅于50 mL液體培養基，25 ℃ 150 r/min培養10 d；所得到的菌絲用無菌濾布過濾，并用無菌水沖洗干凈，再用吸水紙將充分吸干水分，然后放于滅菌研缽中，加入液氮并充分研磨，再轉移至50 mL離心管，放于冷凍干燥儀中，干燥過夜，得到菌絲樣品。

1.3.2 代謝產物的提取 稱取30 mg干燥后菌絲于離心管內，加入6 mL甲醇提取液，在渦旋儀上1 400 r/min劇烈渦旋10 min，直到菌體徹底懸浮，搖動數小時后，離心10 min。轉移1 mL上清于2 mL離心管中，使用氮吹儀用氮氣吹干，得到菌絲代謝產物樣品。

1.3.3 衍生化處理 甲基衍生化：將“1.3.2”所得代謝產物樣品加入200 μL NaOH(1%，0.1 g/mL)200 μL甲醇/吡啶混合溶液(體積比 5∶1)、20 μL 氯甲酸甲酯(MCF)，震蕩1 min；加入800 μL色譜純氯仿，上下劇烈顛倒；加入400 μL NaHCO3(50 mmol/L，4.2 g/L)，上下劇烈顛倒，取下層清液于新的1.5 mL離心管中；加入Na2SO4干燥，靜置5 min轉移500～700 μL于GC-MS進樣瓶中，待測。

硅烷衍生化：將“1.3.2”所得代謝產物樣品中加入100 μL的1 mol/L HCl，劇烈渦旋10 min，直到管內物質充分接觸懸浮；50 ℃孵育1 h，吹干，加入50 μL TMS硅烷化試劑(TMSI∶ TMCS=100∶1)劇烈渦旋10 min，保證管內所有物質與TMS充分接觸，37 ℃孵育1 h，加入800 μL色譜純異辛烷，再加入800 μL超純水上下輕微顛倒，靜置10 min直到分層，轉移500～700 μL有機相于GC-MS進樣瓶中。

1.4 GC-MS檢測方法

1.4.1 甲基衍生化分析方法 載氣He，0.9 mL/min；清洗流速3 mL/min，壓力：49.3 kPa。

升溫程序：柱溫60 ℃(5 min)，保持2 min，以8 ℃/min升溫至180 ℃保持5 min，以40 ℃/min升溫至220 ℃保持5 min，以40 ℃/min升溫至240℃保持12.5 min；進樣口溫度260 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL。

質譜轟擊電壓70 eV，EI模式，接口溫度 260 ℃；離子源溫度260℃；檢測器電壓1.0 kV；溶劑切割時間3 min；掃描范圍35～550m/z。

1.4.2 硅烷衍生化分析方法 載氣He，1 mL/min；清洗流速3 mL/min，壓力：80.8 kPa，分流比5.0。

升溫程序：柱溫120 ℃(5 min)，保持5 min，以4 ℃/min升溫至300 ℃保持15 min；進樣口溫度260 ℃；進樣量1 μL。

質譜轟擊電壓70 eV，EI模式，接口溫度 275 ℃；離子源溫度200 ℃；檢測器電壓1.0 kV；溶劑切割時間3 min；掃描范圍35～550m/z。

1.4.3 數據處理 使用島津氣相色譜質譜聯用儀自帶NIST08和NIST08s兩個譜庫對結果進行檢索，對相似度70%以上的代謝產物進行 指認。

2 結果與分析

2.1 菌絲培養條件對代謝產物的影響

分別選取培養5 d、10 d、15 d、20 d和25 d 5個時間段的野生型PH-1菌株進行測試，觀察培養時間對代謝產物的影響，經TMS衍生化后的結果發現培養10 d所得菌絲的代謝產物最充分，大部分產物在總離子流圖上的響應值最高，適宜代謝產物的分析，結果見圖 1。選用2種不同營養的培養基培養的菌絲樣品進行檢測分析，結果發現在營養豐富的CM培養基中TMS衍生化處理的代謝產物比營養簡單的MM培養基豐富(圖2)。因此，后續試驗選用培養周期10 d和CM培養基作為培養條件。

圖1 PH-1在不同培養時間通過TMS衍生化后的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) plot of PH-1 cultured in different time with TMS derivatization

圖2 來自MM和CM培養基中的經過TMS代謝物總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram(TIC) plot of MM medium and CM medium with TMS derivatization

2.2 MCF衍生化結果分析

采用MCF甲基衍生化后進行GC/MS分析，檢測結果總離子流圖見圖3，根據NIST08和NIST08s譜庫指認代謝產物26種，結果見表1，使用面積歸一化法計算物質質量分數百分比，其中氨基酸類物質有6種，比例為1.62%；烷烴烯烴類物質9種，占7.4%；7種脂肪酸類物質，占74.52%，其他酯類醛類占16.46%。

2.3 TMS衍生化結果分析

通過TMS硅烷衍生化后進行GC/MS分析，檢測結果總離子流圖見圖4，根據NIST08和NIST08s譜庫指認代謝產物37種，結果見表2，使用面積歸一化法計算物質質量分數，其中糖醇類物質29種，占96.24%；脂肪酸檢測到3種約占1%，另外其他物質主要是麥角固醇類等約占3%。

圖3 MCF衍生化野生型赤霉菌代謝產物的GC/MS分析總離子流圖Fig.3 Total ions chromatogram of PH-1 metabolites with MCF derivatization by GC/MS

表1 MCF衍生化野生型赤霉菌代謝產物的GC/MS分析結果Table 1 Result of PH-1 metabolites with MCF derivatization by GC/MS

圖4 TMIS衍生化野生型赤霉菌代謝產物的GC/MS分析總離子流圖Fig.4 Total ions chromatogram of PH-1 metabolites with TMS derivatization by GC/MS

3 討論與結論

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)是小麥赤霉病的一種優勢致病菌，能導致小麥產量和品質的嚴重下降，并產生有害的真菌毒素，給小麥生產的可持續發展帶來了很大困難。利用代謝組學分析手段研究小麥赤霉病禾谷鐮刀菌所產生代謝物的質和量的動態變化規律，可進一步了解抗病機制，最終實現小麥赤霉病的防治。

氣相色譜質譜聯用(GC-MS)是代謝指紋分析的常用手段，然而對禾谷鐮刀菌的代謝產物分析尚未有報道。本研究構建了禾谷鐮刀菌代謝產物的分析方法，通過篩選代謝產物多樣化的培養條件，發現10 d和CM培養基為產物多樣化的培養條件，進一步針對不易氣化的代謝產物，采用2種衍生化方法，分別分析了其代謝產物。其中氯甲酸甲酯(MCF)作為酰基化試劑，衍生化反應迅速、產物單一且結構穩定，能同時衍生有機酸、游離脂肪酸、酚類、氨基酸類和胺類物質，通過MCF衍生化發現了26種代謝產物。其中氨基酸類物質有6種，烷烴烯烴類物質9種，脂肪酸類物質7種，其他酯類醛類4種。硅烷化(TMS)也是常見的衍生化試劑，此類衍生化產物具有易于制備、衍生化后可直接進行氣相色譜分析的特點,這樣節省了樣品制備時間，通過TMS衍生化發現了37種代謝產物，其中糖醇類物質29種，脂肪酸檢測到3種，其他麥角固醇類5種。比較該2種衍生化方法，發現MCF衍生化可檢測的種類有氨基酸、烷烴烯烴和脂肪酸類等，而TMS衍生化主要檢測了糖醇類，二者相互補充。根據以上2種衍生化處理的指紋圖譜結果可以看出糖醇類物質和脂肪酸類物質是禾谷鐮刀菌的主要代謝產物，其他氨基酸類、烯烴、烷烴等物質質量分數不高，但也是常規存在的代謝產物。

表2 TMIS衍生化野生型赤霉菌代謝產物的GC/MS分析結果Table 2 Result of PH-1 metabolites with TMS derivatization by GC/MS

本試驗采用2種不同衍生化方法，對禾谷鐮刀菌的野生型菌株樣品進行了代謝指紋分析共指認出63種代謝產物，質量分數較高的為糖醇類物質和脂肪酸類物質；比較了不同的培養時間和培養基對禾谷鐮刀菌代謝產物的影響，發現10 d的培養時間代謝產物最完全，適宜做代謝產物的分析；培養基的營養對代謝產物有一定的影響，營養豐富的培養基培養的菌絲代謝產物相對更豐富。通過以上研究為禾谷鐮刀菌深入的代謝組學研究提供參考，也為禾谷鐮刀菌致病機理研究提供 依據。