低滲溶液促進小麥種子萌發的生理機制

馮 岳，魏永勝，馮 浩

(1.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100；2.中國科學院 植物研究所光生物學重點實驗室 100093；3.中國科學院大學 生命科學學院，北京 100049；4.西北農林科技大學 國家節水灌溉楊凌技術研究中心，陜西楊凌 712100)

種子引發(Seed priming)是一種基于種子萌發的生物學技術手段[1]，由Heydecker于1973年最早提出[2]，經由特定預處理方法使種子緩慢吸水，確保種子萌發的代謝活動順利進行，進而提升種子活力，其目標是提高種子的萌發率，并且能增加萌發穩定率和萌發整齊度，進而增加苗的抗性并改良營養狀況。近年來，種子引發相關技術對植物的大量研究成果已在農業貿易生產上取得成功運用[3-4]。

常見的引發方法有水引發[5-6]，無機鹽引發如KCl和CaCl2[7]，有機物引發如PEG 6000[8]，甚至是納米材料如納米銀(Silver nanopaticale，AgNPs)[9]等，引發技術現已應用于小麥[7,10]、玉米[3]、水稻[8,11]、番茄[12]、豆類[13]及煙草[14]等作物。如，水引發處理水稻種子可以使萌發時間縮短26.8 h，苗高增加為對照的1.2倍，干質量增加至對照的1.3倍[11]。盡管引發作為一項農業生產技術已經被廣泛使用，但機理研究并不深入。一般認為水引發或適度的滲透溶液引發可使種子通過了類似的“逆境鍛煉”[15]，給予種子更充分的機會修復細胞膜，提高種子的淀粉酶活力[9]，促進種子代謝，提高種子的保護酶活性[8]，促進DNA修復[16]，增加水孔蛋白表達[17]等。但上述研究未能解釋為什么適度的滲透溶液引發的效果優于純水引發，是否在純水中引發時吸水過快會造成細胞原生質膜的機械損傷，適度滲透溶液引發處理是促進膜修復還是減輕快速吸水造成的機械損傷等問題。

本研究切入點為確定小麥種子最佳的引發條件，從引發過程中小麥種子物理與生理生化兩個方面的變化去揭示引發的機制，以揭示為什么輕微滲透脅迫的引發處理優于純水或高滲透溶液，進一步揭示引發的機制，為科學利用引發技術提高作物產量、改善品質提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以小麥品種‘小偃22’(TriticumaestivumL.)的陳種子(購于2015年)為材料，以NaCl(分析純，西安化學試劑廠)為引發劑。選用陳種子作為材料是因為其更能反映引發的效果[18]。經TTC法測定，種子活力為(81.0± 3.35)%。

1.2 試驗設計

1.2.1 引發效應的確認 分別以純水(0 MPa)和水勢為-0.1、-0.3、-0.5、-0.7、-0.9、 -1.2 MPa NaCl溶液引發處理小麥種子，以證明引發現象存在并確定最佳的引發條件。小麥種子經75%酒精消毒，置于室溫(15.5±2.0)℃下，在相應的NaCl溶液中避光浸泡12 h，取出后拭干水分并避光風干24 h作為引發處理，然后進行萌發試驗。萌發試驗取引發處理后的種子各50粒，置于鋪有2層濾紙的9 cm培養皿中，加無菌水5 mL，在(20.5±2.0)℃恒溫培養箱(KRC-100CL，上海齊欣科學儀器公司)中避光培養，每24 h補充無菌水5 mL并統計發芽粒數，以胚根突破種皮，長度為0.5 cm時為萌發，發芽種子移出培養皿。連續7 d無種子萌發時終止萌發試驗。每個處理5次重復(共250粒)。以經過活力調整的萌發率為萌發指標：G=Ng/(Nt·Vi)×100%

式中：G為萌發率(%)；Ng為試驗期內累計萌發種子數；Nt為每個培養皿中供試種子數；Vi為TTC法測定的小麥種子活力。

1.2.2 NaCl引發的生理機制 (1)建立吸水曲線：取未經引發的干種子、經純水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引發處理的種子分別放入5個培養皿中，加5 mL純水(每皿50粒，每個處理5個重復共250)，置于(20.5±2.0)℃培養箱中培養，分別在0、6、12、24、36、48、72和96 h稱量，記錄質量，稱量前拭干水分，稱量后放回培養皿。以相對質量(吸水后質量÷吸水前的初始質量)對吸水時間作圖。

(2)生理指標測定：種子細胞膜相對透性、MDA質量摩爾濃度、可溶性蛋白、α-淀粉酶活性及總淀粉酶活性等生理指標測定參考高俊鳳[19]主編的《植物生理學實驗指導》。以未經引發的種子作為對照，以0、-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液引發的種子(風干24 h后)為處理測定相關生理指標。測定設5個重復，每個重復25粒。

(3)對比KCl引發：將經純水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引發處理的種子與經 -0.3及-0.7 MPa KCl溶液引發處理的種子分別放入5個培養皿中(每皿50粒，每個處理5個重復共250)，加5 mL純水，置于(20.5±2.0)℃培養箱中培養，每24 h補充無菌水5 mL并統計發芽粒數，記錄萌發進程，以初步探究K+、Na+對引發產生的不同效應。

1.3 數據處理

利用Excel對數據分析并作圖，并利用Chapman 3-parameter模型對萌發曲線進行擬合，計算萌發率達到50%所需要的時間 t50，以及萌發率達到5%所需要時間 t5 (因為試驗每個重復為50粒，故以有2粒以上種子萌發時刻作為萌發的啟動時間)。利用R軟件進行統計分析，進行差異顯著性檢驗。文中數據以“平均值±標準誤”表示，插圖中的誤差棒均為標準誤。

2 結果與分析

2.1 低濃度NaCl引發處理下小麥種子萌發情況

不同水勢的NaCl溶液引發處理對小麥種子萌發率的影響有顯著差異(圖1)。最終萌發率(吸水192 h)在-0.3 MPa處理下最高，為 (89.2±3.9)%，0～-0.3 MPa之間隨著水勢下降而升高，而-0.3～-1.2 MPa則隨水勢降低而降低，在-0.7 MPa萌發率開始低于50%。因此，后續試驗中以純水，-0.3 MPa(最佳)和 -0.7 MPa(<50%)的NaCl溶液引發處理種子進行研究，以未引發的干種子為對照(CK)。

從萌發的進程看，純水引發處理的種子萌發啟動時間(萌發率5%)較-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液處理的種子分別早2.47和22.67 h，萌發率達到50%所需時間比-0.3 MPa NaCl溶液處理早4.05 h，但萌發率在120 h后開始低于 -0.3 MPa引發處理的種子直至試驗結束。而 -0.7 MPa NaCl溶液引發處理的種子最終萌發率低于50%，且萌發啟動遲緩。

2.2 NaCl引發處理對小麥種子吸水過程的影響

試驗中種子吸水過程依據吸水速率可分為快、慢、快3個時期，第一個時期為0～24 h，吸水曲線平均斜率為(1.62±0.28)×10-2(表1)；第二個時期為24～72 h，斜率為(0.76±0.11) ×10-2；第三個時期為72～96 h，斜率為(1.21± 0.02) ×10-2。在吸水初期(0～24 h)，與未經引發處理的種子相比，無論是純水還是-0.3和 -0.7 MPa NaCl溶液引發處理，其吸水速率均較低(圖2)。但24和48 h后，純水和-0.3 MPa引發處理的種子吸水速率先后超過未引發的種子，而-0.7 MPa NaCl溶液引發處理的種子吸水速率全程處于最低水平。與純水引發相比，-0.3 MPa引發處理的種子吸水初期吸水速率較低，但24 h后二者相近，但吸水量后者始終低于前者。經純水、-0.3和-0.7 MPa引發處的種子到達相對質量150%所用時間分別為23.6、37.6和53.8 h。

實線為不同水勢溶液中種子萌發過程的擬合曲線，不同的點為實測值

Solid line in the figure is the fitting curve of seed germination process in different water potential solutions.The different points are measured values

圖1 低濃度NaCl引發處理小麥種子的萌發率
Fig.1 Promotion of wheat seed germination under treatment of hypoosmotic NaCl priming

表1 不同引發條件小麥種子吸水速率(斜率)變化Table 1 Changes in water absorption (slope ) of wheat seeds during different germination periods under different priming conditions

注：數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05).Duncan’s法多重比較。下同。

Note：Different lowercase letters show significant difference in table(P<0.05).Duncan’s method multiple comparison.The same below.

虛線表示相對質量為150%

Dotted line indicates relative mass of 150%

圖2 不同引發處理的小麥種子吸水過程
Fig.2 Water absorption process of wheat seeds under different priming treatments

2.3 適度NaCl引發處理對小麥種子膜完整性的影響

經-0.3 MPa NaCl溶液處理的種子其MDA質量摩爾濃度(圖3-A)和相對電導率(圖3-B)均顯著低于其他處理，而經-0.7 MPa 處理的種子其MDA質量摩爾濃度與未經處理和純水引發的種子差異不顯著，但相對電導率顯增加，表明純水對萌發中的種子的傷害可能更多地來源于機械損傷，如膜撕裂，而不是化學因素造成的傷害。同理，與-0.3 MPa NaCl溶液處理相比，未引發種子和純水引發后的種子中MDA質量摩爾濃度和相對電導率均上升，且未引發種子的細胞膜相對透性顯著高于-0.3 MPa NaCl溶液處理，同樣表明種子在純水中萌發會傷害細胞膜，且主要是機械傷害。

2.4 NaCl引發處理對小麥種子可溶性蛋白質量分數的影響

與未經引發的種子相比，經過引發后的種子其可溶性蛋白質量分數顯著增加(圖3-C)。經 -0.3 MPa NaCl溶液處理后其可溶性蛋白質量分數顯著高于未經引發的種子和純水引發的種子，高于-0.7 MPa處理，但差異不顯著。但同樣處理的種子由另一獨立小組測定的結果與本試驗中結果有相同變化趨勢(結果未公開)，因此，-0.3 MPa NaCl溶液處理后可溶性蛋白質量分數高于-0.7 MPa處理的結果也是肯定的。分析萌發數據，可以推定這些增加的可溶性蛋白更多的是與萌發相關的功能性蛋白，而不是類似于 -0.7 MPa處理后脅迫蛋白。究竟是哪些相關蛋白增加，有待于通過蛋白組學研究來揭示。

圖中柱上不同小寫字母表示處理間差異達5%顯著水平

Different lower-case letters indicate statistically significant difference under different treatments (P<0.05)

圖3 不同引發條件下小麥種子的丙二醛質量摩爾濃度(A)、相對電導率(B)、可溶性蛋白質量分數(C)
Fig.3 Malondialdehyde molality，relative electrical conductivity and soluble protein fraction in wheat seeds under different priming conditions

2.5 NaCl引發處理對小麥種子淀粉酶活力的影響

萌發過程中，種子中的α-淀粉酶活性(圖4-A)和總淀粉酶活性(α-淀粉酶和β-淀粉酶活性之和)(圖4-B)均隨萌發時間的延續而增加。萌發率與同期α-淀粉酶和總淀粉酶活性的相關性分別為0.73和0.74，而與前24 h α-淀粉酶和總淀粉酶活性的相關性分別為0.75和0.77。表明萌發率與淀粉酶活性相關，但更多地受萌發前的淀粉酶活性影響，尤其是β-淀粉酶活性。成對t檢驗結果(表2)顯示，純水引發與未經引發種子的α-淀粉酶活性差異不顯著，但總淀粉酶活性的差異達到極顯著水平。表明純水引發主要是提高了β-淀粉酶活性，而非α-淀粉酶活性。-0.3 MPa引發處理的種子的α-淀粉酶顯著高于其他處理，但總淀粉酶活性與純水處理間無差異。表明適當鹽脅迫處理可以提高α-淀粉酶活性，促進萌發。而-0.7 MPa引發處理的種子的α-淀粉酶和總淀粉酶活性均較低，這可能是萌發率低的原因之一。

圖4 引發后的小麥種子的淀粉酶活性在萌發過程中淀粉酶活性的變化Fig.4 Amylase activity of wheat seeds during germination of seeds after different priming conditions

2.6 NaCl和KCl分別引發處理對小麥種子萌發進程的影響

為進一步確認-0.3 MPa NaCl溶液處理可提高小麥種子萌發率的原因，對同為-0.3 MPa 的NaCl和KCl溶液的引發效果進行比較，結果(圖5)顯示，2種鹽溶液都在-0.3 MPa引發處理下最終萌發率最高，但是從整個萌發過程來看，-0.3 MPa KCl引發處理的種子在萌發初期即表現出相對較好的萌發活力，且最高萌發率大于純水處理，而-0.3 MPa NaCl引發處理的種子是在中后期萌發率超過純水處理，達到最高萌發率相對較晚。這表明引發處理不僅是水勢降低的效果(滲透脅迫)，也會受引發劑性質的影響，本試驗中K+效果會優于Na+。

表2 不同引發處理對淀粉酶活性影響的顯著性對比Table 2 Significant comparison of effects of different priming treatments on amylase activity

注：**：差異極顯著(P≤0.01)，*：差異顯著(0.01

Note：**:Extremely significant(P≤0.01), *:Significant(0.01

圖5 NaCl和KCl分別引發處理的小麥種子萌發進程Fig.5 Germination processes of wheat seeds primed by NaCl and KCl

3 討 論

本研究中，經不同水勢NaCl溶液處理后的小麥種子最終萌發率存在顯著差異，適度的低水勢溶液(-0.3 MPa)處理的種子萌發率最高，確認了引發現象的存在。但與純水處理的種子相比，萌發啟動晚(圖1)。其他研究也表明這種適度的低水勢溶液處理種子萌發率高，而且后期出苗整齊，抗性增強[9,20]，這也正是種子引發技術在生產中得到廣泛應用的原因。但適度的低水勢溶液(-0.3 MPa)處理的種子萌發啟動晚，但后期萌發速率快的現象未見報道。

引發處理可以改善種子的吸水量進而影響種子的萌發率[21]，干種子內部襯質勢較高，吸脹速率過快，可能會對細胞膜產生傷害[6]，引發處理被認為可以緩解這種損傷，并有利于膜系統修復[22]。細胞膜脂質過氧化可導致MDA質量摩爾濃度的上升，并進一步傷害膜[23]，若膜損傷以機械撕裂為主，則透性增加會更為突出。本試驗結果顯示，與未經引發處理的種子相比，純水和 -0.3 MPa NaCl溶液引發處理的種子吸水速率在24和48 h后分別超過未經引發處理的種子，這可能與吸水初期較慢的吸水速率使得使膜受到較少傷害或得到一定修復，并增加水孔蛋白表達有關。由于純水和-0.3 MPa NaCl溶液引發的種子中MDA質量摩爾濃度(圖3-A)和細胞膜相對透性(圖3-B)均低于未經引發處理的種子。純水引發與-0.3 MPa NaCl溶液引發相比，后者吸水速率(表1)和吸水量均低于前者(圖2)，萌發啟動晚(圖1)，但最終萌發率最高。表明吸水多并不一定萌發率高。而且純水引發的種子不僅是細胞膜相對透性增加，且MDA產生量較 -0.3 MPa引發處理后的種子更高，說明-0.3 MPa NaCl溶液引發處理后種子的膜破壞性最小或修復得更好。這與部分學者的研究相吻合，肖雪峰等[24]的研究發現PEG能通過滲透作用有效改善植物細胞膜的滲透勢，控制種子萌發時水分的進入，有效降低或消除種子吸水過快的情況，使種子有足夠時間完成生物膜的修復。

α-淀粉酶是小麥中淀粉水解的關鍵酶，直接關系到幼苗的建成[25]。本研究也表明，經過引發后種子中可溶性蛋白增加(圖3-C)，淀粉酶活性增強，萌發率與淀粉酶活性相關，但更多地受萌發前(引發后)的淀粉酶活性影響，尤其是β-淀粉酶活性，且-0.3 MPa引發處理可以提高α-淀粉酶活性并間接促進了β-淀粉酶在萌發過程中的生成，進而促進萌發。α-淀粉酶活性的增加，可能會增加更多的可溶性糖，進而增加種子內外水勢差，增加吸水速率。但實際結果是-0.3 MPa NaCl引發與純水引發相比，吸水速率和吸水量均較低。因此，淀粉水解后的糖可能更多地被呼吸利用或轉化為其他物質，而不是作為溶質降低水勢來增加吸水動力。

鉀元素為小麥必需的大量礦質元素，而鈉元素僅為有益元素，分別以同樣摩爾濃度的NaCl和KCl溶液處理小麥種子，檢測對萌發過程的影響，有利于區分Na+和K+的生理效應。盡管有關于不同引發劑效應的研究[22]顯示了不同化合物之間引發處理結果上的差異，但以往的研究沒有去區別不同離子的效應。本研究結果表明引發處理不僅是水勢降低的效果(滲透脅迫)，也會受離子差異的影響，本例中K+效果優于Na+，即使是-0.7 MPa處理下，K+效果也優于Na+，但原因尚不清楚。

綜上所述，NaCl適度脅迫引發(-0.3 MPa)和純水引發均可以提高小麥種子萌發率，未經引發和純水引發的種子在吸水過程中快速吸水傷害細胞膜，而-0.3 MPa NaCl引發處理則減少了細胞膜所受的傷害，提高淀粉酶，尤其是α-淀粉酶活性促進萌發。這種萌發率的提高，不是通過增加吸水速率或吸水量實現的。未來研究中，應注意引發處理的種子在萌發過程中不同時刻的物質變化。