microRNA在非酒精性脂肪性肝病中的研究進展

梅迪華 杜國平

【摘要】 非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精、病毒感染及其他明確病因所致的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合征。隨著人們生活水平的不斷提高，NAFLD的發病率明顯升高。目前NAFLD已成為世界上最常見的慢性肝臟疾病，嚴重威脅人們的健康，但其發病機制尚不明確。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度約為22個核苷酸的具有調控功能的內源性非編碼RNA，miRNA與NAFLD中的脂質代謝、胰島素抵抗、炎癥反應、細胞凋亡、纖維化等環節有著密不可分的關系。本文主要就miRNA在NAFLD發生發展過程中發揮的重要作用做一綜述，以期未來成為NAFLD新的診斷指標及治療靶點。

【關鍵詞】 microRNA 非酒精性脂肪性肝病 差異性表達

Advances in the Study of microRNA in Non-alcoholic Fatty Liver Disease/MEI Dihua， DU Guoping. //Medical Innovation of China， 2020， 17（02）： -168

[Abstract] Non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） refers to a clinicopathic syndrome characterized by alcoholic， viral infection and other definite causes of hepatic parenchymal cell steatosis and fat storage. With the continuous improvement of peoples living standards， the incidence of NAFLD has increased significantly. At present， NAFLD has become the most common chronic liver disease in the world， which is a serious threat to peoples health， but its pathogenesis is still unclear. microRNA （miRNA） is endogenous non-coding RNA with regulatory functions， which is approximately 22 nucleotides in length. Studies have shown that miRNA has a close relationship with lipid metabolism， insulin resistance， inflammation， apoptosis， and fibrosis in NAFLD. This article reviews the important role of miRNA in the development of NAFLD， in the hope of becoming a new diagnostic indicator and therapeutic target for NAFLD in the future.

[Key words] microRNA Non-alcoholic fatty liver disease Differential expression

First-authors address： Graduate School of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.02.042

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精、病毒感染及其他明確病因所致的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合征，疾病譜包括單純性脂肪肝（non-alcoholic simple fatty liver disease，NAFL）、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝癌[1]。近年來，世界各地NAFLD發病率均在升高，全世界NAFLD的患病率為25.24%[2]，其中北美洲24.1%，歐洲23.7%，NAFLD已成為世界上最常見的慢性肝臟疾病。隨著我國經濟的不斷發展，人民生活水平的不斷提高，生活習慣和飲食結構發生巨大改變，且NAFLD常常和肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、脂代謝紊亂、高血壓等合并存在，使我國NAFLD的發病率大大提高，目前我國NAFLD患病率為20.09%，上海等華東地區NAFLD患病率竟高達43.3%[3]，這對我國人民的健康造成巨大危害。

目前對NAFLD的發病機制尚不清楚，“二次打擊”學說是目前受到廣泛認同的經典發病機制。第一次打擊與胰島素抵抗、脂質代謝紊亂密切相關。游離脂肪酸在肝臟β-氧化的主要場所為線粒體、微粒體和過氧化物酶體。胰島素抵抗和高胰島素血癥促進了外周脂肪組織釋放游離脂肪酸入肝，加速了肝細胞對游離脂肪酸的利用，促使了過量的甘油三酯在肝臟合成。而肝細胞對游離脂肪酸的過度攝入又會導致線粒體氧化磷酸化和脂質β-氧化呈超負荷狀態，極低密度脂蛋白合成或分泌減少，甘油三酯轉運異常，加重肝臟脂肪堆積，導致肝細胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝。在首次打擊的基礎上，產生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），一方面當ROS的產生及其作用超過肝細胞本身的抗氧化系統清除能力時，便會誘導肝實質細胞的氧化應激反應，另一方面ROS與不飽和脂肪酸反應形成大量的脂質過氧化產物（lipid per oxide，LPO），LPO通過抑制線粒體呼吸鏈的電子傳遞，又會產生大量的ROS與LPO，形成惡性循環，從而導致肝細胞炎癥反應、凋亡、壞死，最終引起肝臟纖維化、肝硬化和肝細胞癌，此為“第二次打擊”[4]。然而，隨著研究的不斷深入，人們發現“兩次打擊假說”已經開始過時，因為它不足以解釋NAFLD中發生的所有分子和代謝變化。越來越多的人認為，多種因素作用于患者以誘導NAFLD，這些因素包括胰島素抵抗、從脂肪組織分泌的激素、營養因子、腸道菌群、遺傳和表觀遺傳因子等[5]。多種因素的聯合分析更能準確地解釋NAFLD的發病機制，這種說法被稱為“多重打擊”假說[6]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長度約為22個核苷酸的具有調控功能的內源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。成熟的miRNA由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex），miRNA中5端中的“種子區域”通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA的3非翻譯區（3-UTR），并根據配對互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。miRNA具有廣泛的生物調節功能，與機體生長發育、細胞代謝、增殖、分化、凋亡、腫瘤形成等密切相關[7]。最近研究表明，miRNA與NAFLD中的脂質代謝、胰島素抵抗、炎癥反應、細胞凋亡等環節有著密不可分的關系[8]。本文主要就miRNA在NAFLD發生發展過程中發揮的重要作用做一綜述，以期未來成為NAFLD新的診斷指標及治療靶點。

1 NAFLD發展過程中miRNA的表達譜變化

多項研究表明，NAFLD中存在miRNA的差異性表達，Cheung等[9]通過對比15例NASH患者及15例健康者的肝組織中miRNA的基因譜芯片數據分析，并采用逆轉錄PCR（RT-PCR）對芯片結果進行驗證，提示包括miR-34a和miR-146b的23種

miRNA表達上調，包括miRNA-122在內的23種miRNA表達下調。此外，在NAFLD發生發展的不同階段，miRNA的差異性表達情況也各不相同。Miyaaki等[10]在NAFLD患者的肝臟和血清中檢測miR-122，發現其在單純脂肪肝變性或者NASH中表達明顯上調，且與肝細胞脂肪變性嚴重程度呈正相關。但在肝纖維化中miR-122表達明顯下調，與肝纖維化嚴重程度呈負相關，揭示了miR-122在NAFLD不同的病變發展階段，表達水平也存在差異。見表1。

2 miRNA參與調節NAFLD的研究進展

通過對NAFLD中miRNA差異性表達的進一步研究，研究人員發現miRNA參與到調控NAFLD的各個病理改變過程，尤其是miRNA-34a、miRNA-122、miRNA-29、miRNA-21等與NAFLD中葡萄糖及脂質代謝、氧化應激、炎癥反應的發生發展過程密切相關[8]。下面就以上miRNA近幾年來對NAFLD發病的具體調控機制做一闡述。

2.1 miRNA-34a 大量研究表明，miRNA-34a可能參與到NAFLD中脂質代謝、氧化應激、凋亡等相關信息通路中[22-25]。在NAFLD中miR-34a與沉默信息調節因子1（SIRT1）相關。SIRT1是一種依賴于NAD的去乙?；福鳛镹AD的主要代謝傳感器，在包括NAFLD在內的代謝疾病中起著至關重要的作用。Castro等[22]研究發現，miR-34a通過抑制SIRT1表達，促進p53乙?；饔眉稗D錄，使促凋亡基因puma增加，從而參與肝細胞的凋亡，即miR-34a/SIRT1/p53通路參與調控肝細胞凋亡過程。

p66shc是SHCA適配器分子的一個異構體，是一種氧化還原酶，參與促進線粒體氧化信號的凋亡。Shan等[23]發現，在高脂肪飲食大鼠體內及膽酸誘導的肝細胞中，過表達的miR-34a通過抑制SIRT1表達，增加了p66shc的表達水平，促進ROS的氧化應激反應，誘導細胞凋亡。而鼠尾草酸（carnosic acid，CA）通過抑制miR-34a/SIRT1/p66shc信號通路，導致Caspase-3水平明顯降低，Bcl-XL上調，對NAFLD肝細胞凋亡起到保護作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）作為核激素受體家族中的一員，具有調控細胞代謝的作用，而PPARα作為PPARs其中的一個亞型，主要在肝臟中調控脂肪酸（FA）代謝酶和線粒體FA氧化（FAO）活性基因的組成轉錄，通過激活線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β-氧化途徑，實現對脂質的轉運和代謝調節。Ding等[24]發現，PPARα作為miR-34a的直接靶向目標基因，在使用miR-34a抑制劑后其蛋白表達水平上調，通過誘導CPT1和CPT2（均參與脂肪酸β-氧化），SLC27A1、SLC27A4和ACBD3（均參與脂肪酸轉運）等脂質代謝基因的轉錄，導致甘油三酯及肝臟指數的下調，激活AMPK通路，最終PPARα和pAMPKα1的表達上調增加了脂肪氧化，即miR-34a-PPARα-AMPK途徑參與到NAFLD脂肪變性的調節過程。

此外，miR-34a-HNF4α（肝細胞核因子4α）通路也能調節肝臟和血漿的脂質代謝[25]。miR-34a通過結合到3UTR的第二個結合位點，抑制HNF4α的表達，并以一種依賴HNF4α的方式抑制VLDL的分泌，導致肝臟甘油三酯積累，引起脂肪變性。同時該通路引起血漿中甘油三酯及膽固醇的減少，對動脈粥樣硬化起到一定的預防和保護血管的作用。

2.2 miRNA-122 miRNA-122是肝臟中表達最豐富的微小RNA，約占肝臟miRNA的70%。miRNA-122是肝臟中脂質代謝的關鍵因素。在HepG2細胞的體外研究中發現，miR-122的沉默導致脂質代謝基因，例如脂肪酸合成酶（FAS）、HMGCR還原酶、固醇結合元件結合蛋白（SREBP）等表達的上調[10]。Miyaaki等[10]發現miR-122在單純脂肪肝變性或者NASH中表達明顯上調，且與肝細胞脂肪變性嚴重程度呈正相關。CYP7A1是膽固醇合成膽汁酸的限速酶。在慢病毒介導的抑制miR-122表達的肝細胞中，CYP7A1表達上調，從而增加膽汁酸的產生并降低肝細胞中的膽固醇水平，表明肝臟膽固醇水平的降低可能繼發于miR-122的抑制，miR-122是膽固醇代謝的關鍵調節因子[26]。除此之外，miR-122還能介導控制AMPK和PPAR家族等晝夜節律代謝調節因子的表達，調節脂質代謝，而miR-122基因的轉錄本身發生在晝夜節律中，表明miR-122、晝夜節律基因表達和肝臟脂質代謝之間存在聯系[27]。

同時miR-122在NAFLD的炎癥反應及纖維化中起著關鍵作用。白細胞介素-1A（IL-1A）是一種與炎癥反應相關的多向性細胞因子，它分為DD、ID及Ⅱ三種基因型，其中DD基因型攜帶者中的血清IL-1A高于攜帶ID和Ⅱ基因型NAFLD患者。研究發現，miRNA-122表達水平與血清IL-1A呈正相關，miR-122通過調控攜帶高風險DD基因型的IL-6基因的轉錄水平，參與NAFLD的炎癥反應，增加了個體患上NAFLD的風險[28]。Bandiera等[27]研究表明，表達miR-122基因缺失的小鼠，在補充了miR-122后能夠抑制趨化因子CCL2，從而減少在肝內募集CD11bhiGr1+的炎癥細胞及促纖維化Krüppel樣因子6（KLF6）的表達，改善炎癥反應。Hossein等[26]發現在慢病毒介導的抑制miR-122表達的多細胞三維人肝器官模型中，庫普弗細胞（Kupffer cell，KC）能促進各種炎癥因子（IL-1b、IL-12、TNF-α）和促纖維化細胞因子（如CCL2、CCL3、CCL5）的分泌，導致進一步的肝細胞損傷和損傷相關分子模式（DAMP）的釋放，誘導加強KCs、肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化并引發炎癥及纖維化反應。以上說明，miR-122除了對肝臟脂質代謝產生重要影響，對NASH和肝纖維化也起著關鍵作用。

此外，缺失miR-122的小鼠易于快速發展為脂肪性肝炎、纖維化和肝癌[29]。而miR-122可以結合Wnt1 mRNA的30-UTR進行抑制，下調Wnt1、β連環蛋白和TCF-4的蛋白水平，抑制Wnt信號通路，達到促進細胞凋亡的目的。這表明HCC中miR-122的缺失可能導致過量的Wnt信號通路傳導，肝臟miR-122的失調有助于NAFLD向HCC發展[30]。

2.3 miRNA-29 miRNA-29家族是胰腺及肝臟中表達最豐富的miRNA之一。據報道，miR-29是糖尿病的早期標志物，在小鼠模型的胰腺中，miR-29協同上調miR-29a-c，隨后抑制Bcl-2家族蛋白的抗凋亡因子mcl-1，使胰島b細胞發生凋亡，形成1型糖尿病[31]。Pandey等[32]發現，在糖尿病小鼠肝臟中，miR-29a水平明顯升高，它通過靶向抑制胰島素信號級聯中的上游分子PI3K（磷酸肌醇-3-激酶）的表達，以及阻斷胰島素信號下游AKT（蛋白激酶B）磷酸化途徑，形成胰島素抵抗。而胰島素抵抗是NAFLD的發病機制之一，這意味著miR-29家族可能是通過胰島素抵抗途徑參與NAFLD發生發展的關鍵因素。

Duan等[33]研究表明，遠程缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）對NAFLD肝臟缺血再灌注損傷（ischemia and reperfusion，IR）有保護作用，具體機制為RIPC降低了骨骼肌中miR-29a/b/c的表達水平，而miR-29a/b/c通過直接針對誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的3-UTR而下調iNOS的表達，減少一氧化氮的產生。因此，筆者推測miR-29家族也能調控NAFLD中氧化應激產物基因的轉錄水平，參與到肝臟的氧化應激反應過程。

陳軼等[34]發現miR-29b在NAFLD肝纖維化、肝硬化患者血清中的表達明顯下降，提示miR-29b與NAFLD纖維化過程密切相關。Wang等[35]研究發現，miR-29b在人和小鼠纖維化肝組織和原代活化的肝星狀細胞（HSC）中顯著下調，Smad3通過與miR-29b啟動子結合，介導TGF-β1誘導miR-29b下調。而下調的miR-29b又能抑制Smad3表達，減輕對TGF-β1及TGF-β1誘導的促纖維化基因表達的抑制作用，進而放大TGF-β1引起的纖維化信號。此外，miR-29b通過下調p-smad 3、α-sma、Ⅰ型膠原和TIMP-1蛋白表達，對HSC的活化產生抑制作用，同時miR-29b通過直接靶向PIK3R1及AKT3的3TR區域，抑制他們的下游效應子α-SMA和Ⅰ型膠原的表達，從而誘導細胞凋亡。總之，miR-29b通過抑制PI3K/AKT途徑抑制HSC活化和誘導HSC凋亡。雖然這些調控機制不是在NAFLD模型中闡明，但鑒于NAFLD也存在肝纖維化、肝硬化進程，提示miR-29b也可能在NAFLD向肝硬化發展的過程中起作用，其作用的靶點也有可能是一致的。

2.4 miRNA-21 最近研究發現，miRNA-21與NAFLD中的糖脂代謝、炎癥反應、纖維化以及發展成為腫瘤等過程有著密切的關系[36-40]。Benhamouche-Trouillet等[36]發現，敲除了miR-21基因的小鼠肝臟中，葡萄糖耐量以及胰島素抵抗得到明顯改善，具體機制可能是miR-21的缺乏使雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶（RICTOR）和胰島素受體底物2（IRS2）的上調和信號傳導及轉錄激活因子3（STAT3）和AKT蛋白質含量以及磷酸化的增加。Rodrigues等[37]研究表明，miR-21的下調可能導致PPARα的增加，同時參與奧貝膽酸激活法尼醇受體（farnesoid X receptor，FXR）的過程，降低甘油三酯和游離脂肪酸的水平。Li等[38]在HepG2細胞中轉染miR-21模擬物后，發現低密度脂蛋白受體相關蛋白6（low-density lipoprotein receptor-related protein 6，LRP6）在mRNA和蛋白質水平的轉錄和翻譯受到抑制，而miR-21的減少使LRP6的表達水平上升。同時miR-21模擬物在HepG2細胞中的轉染也引發關鍵的脂質代謝酶表達，包括乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（1SCD1）、固醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）和肝X受體α（LXRα），最終誘導脂質產生。Wu等[39]在高脂肪飲食處理的小鼠肝臟和用脂肪酸孵育的人HepG2細胞中，發現HMG盒轉錄因子1（HMG-box transcription factor 1，

HBP1）是miR-21的新靶點和p53的轉錄激活因子，而p53是抑制Srebp1c的腫瘤抑制因子和脂肪生成抑制劑。miR-21的減少導致HBP1和p53的增加，從而減少脂肪生成并延遲G1/S轉換，抑制肝癌發生發展。即miR-21通過與Hbp1-p53-Srebp1c途徑相互作用促進肝臟脂質積聚和癌癥進展。曹海軍等[40]研究發現，與正常大鼠肝臟相比，隨著肝纖維化的進展，肝纖維化大鼠模型組肝臟的miR-21的表達水平逐漸上升，Smad7的表達水平逐漸下降，且miR-21與Smad7呈負相關的關系，揭示了miR-21經TGF-β1/Smad7信號通路參與肝纖維化的發生。

3 展望

隨著人民生活水平的不斷提升，NAFLD的發病率急劇上升，但其發病機制尚不明確，且沒有被批準用于治療NAFLD的藥物。miRNA在多種肝臟疾病中均扮演著重要角色，最近研究表明，miRNA參與調控NAFLD中葡萄糖及脂質代謝、氧化應激、炎癥反應、肝纖維化、肝硬化及肝癌等過程[8]。雖然mi-RNA種類繁多，調控NAFLD的具體作用機制尚不完善，但隨著對miRNA研究的不斷深入，未來將為NAFLD診斷及治療提供一種新的思路和手段。從異常表達的miRNA了解NAFLD的發展程度，同時miRNA作為NAFLD的治療靶點達到治療疾病的目的。

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（收稿日期：2019-11-12） （本文編輯：張爽）

①廣東醫科大學研究生學院 廣東 湛江 524000

②南方醫科大學順德醫院

通信作者：杜國平