乳腺癌患者CTCs、ctDNA檢測及其診斷價值研究

季福慶，李夢婓，印玉龍，呂勇剛

西北大學附屬醫院/西安市第三醫院甲乳外科，陜西 西安 710018

乳腺癌在臨床上具有較高的發病率，其屬于導致女性腫瘤患者發生死亡的主要原因[1]。同時有資料顯示，乳腺癌患者的發病年齡呈現出年輕化的趨勢，已經成為急需解決的公共衛生問題[2]。目前臨床上對乳腺癌患者開展治療的方法包括手術治療、放射治療、化療以及內分泌治療等，若患者存在放療適應證，則在為其開展手術治療后，實施放射治療進行輔助，可有效降低患者的疾病復發率[3]。有資料報道稱，在乳腺癌疾病轉移和復發的過程中，循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)和循環腫瘤細胞DNA(circulating tumor cell DNA，ctDNA)均發揮著重要作用[4]。因此通過檢測CTCs與ctDNA水平，可為乳腺癌的診斷及預后評估起到積極作用[5]。本研究旨在探討乳腺癌患者CTCs、ctDNA的檢測水平及其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2019 年1 月西北大學附屬醫院收治的乳腺癌患者60 例作為觀察組，選取同期在我院接受體檢的女性健康者50例作為對照組。觀察組患者年齡22～75歲，平均(51.8±6.1)歲；病理分期中，Ⅰ期5 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期25 例；絕經前35 例，絕經后25 例。對照組健康者年齡21～77 歲，平均(51.8±6.5)歲；絕經前30例，絕經后20例。兩組受檢者的年齡和絕經情況比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，受檢者均知情并簽署同意書。

1.2 病例選擇 納入標準：(1)乳腺癌經術后病理檢查或穿刺活檢確診；(2)具備完整臨床資料及影像學資料；(3)乳腺癌患者病灶未出現轉移。排除標準：(1)機體存在其他惡性腫瘤疾病者；(2)凝血功能異常者；(3)肝腎功能嚴重障礙者；(4)先天性心臟疾病患者；(5)入組前近期行內分泌外相關治療的患者。

1.3 觀察指標 比較不同特征患者及對照組受檢者的CTCs陽性率與ctDNA水平，包括TNM分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，M 分期為M0 期與M1 期，浸潤型導管癌與浸潤型小葉癌，＞50歲與≤50歲患者。

1.4 檢測方法 采集所有受檢者肘靜脈血7.5 mL，應用肝素實施抗凝處理，在冷卻10 min后采用5 mL磷酸緩沖鹽溶液稀釋，加入淋巴細胞分離液3 mL，離心取血清，加入磷酸緩沖鹽溶液2 mL，混合均勻后離心，去除上清液，加入波形蛋白抗體、細胞角蛋白抗體、CD45各0.5 μL 后混勻，靜置30 min，離心后實施檢測。采用流失細胞分析術開展分析，依靠側向反散射對前向散射做二維散射點，然后設立R1門，同時應用CD45-細胞，根據側向反散射對細胞角蛋白進行二維散射點制作，并應用細胞角蛋白（+）細胞設置R2門。應用R2門細胞通過波形蛋白對上皮細胞黏附分子進行二維散射點制作，采用上皮細胞黏附分子(+)和波形蛋白(+)進行R3 門制作，從而獲取散點圖，對數據開展分析。若檢查結果顯示波形蛋白(+)、CD45(-)、上皮細胞黏附分子(+)以及細胞角蛋白(+)，則可判定為陽性，若CTCs 水平在5/7.5 mL 及以上，則可判定為轉移陽性。采集晨起空腹靜脈血5 mL，放入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管內，離心機中以1 600 r/min速度離心10 min，采集上層血漿，將其裝入離心管內，離心管容量為2 mL，將下層血細胞放入到凍存管內，則得到檢測所需要的血細胞。血漿放入離心機中實施離心處理，殘余細胞去除后，將上清液轉入到離心管內，則得到所需要的血漿，保存于冰箱內待檢。應用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 操作流程開展血漿游離DNA提取，實施傳統DNA測序。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0 統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差()表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的CTCs陽性率比較 觀察組患者 的CTCs 陽性率為38.33% (23/60)，ctDNA 水平為(152.6±12.4)ng/mL；對照組CTCs均為陰性，ctDNA水平為(28.1±4.3) ng/mL，觀察組CTCs 陽性率與ctDNA水平明顯高于對照組，差異均具有統計學意義(t=67.644，P=0.001)。

2.2 觀察組不同特征患者的CTCs 陽性率和ctDNA 水平比較 不同年齡與病理類型乳腺癌患者的CTCs陽性率與ctDNA水平比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；不同乳腺癌TNM 分期患者CTCs 陽性率與ctDNA水平比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 觀察組不同特征患者的CTCs陽性率和ctDNA水平比較

3 討論

乳腺癌是女性高發惡性腫瘤，主要特征為乳頭回縮、乳房皮膚橘皮樣改變和乳頭溢液等[6]。以往臨床上主要采用乳房切除聯合腋窩淋巴結清掃術對患者進行治療，對機體創傷大，手術時間長，容易產生多種并發癥，且術后乳房美觀度差，影響患者的身心健康[7]。近年來，保留乳房手術逐漸受到患者的青睞，同時可達到和傳統手術相似的治療效果，可明顯提高患者術后生活質量[8]。

在乳腺癌的診斷方面，臨床上主要通過傳統影像學檢查和組織學檢查。但是，臨床研究顯示傳統的診斷措施對患者的診斷敏感性不高。近年來隨著液體活檢技術的不斷發展，CTCs 檢測和ctDNA 檢測在臨床上的應用率不斷提升。ctDNA 屬于新型腫瘤標志物，通過對外周血中傳統DNA 總量進行測量，或檢測特定基因發生，可能會為腫瘤疾病的療效評價及預后評估提供參考[9-10]。有研究人員通過選取乳腺癌患者，分別為其開展糖類抗原153、CTCs、影像學檢查與ctDNA檢測，評估4種檢測方法所具備的敏感度，結果顯示ctDNA 可對疾病狀況進行更為高效的反映[11]。同時也有資料報道稱，通過對轉移性乳腺癌與卵巢癌患者的血ctDNA 水平實施檢測，可使疾病的臨床進程得到有效反映[12]。當機體處于健康狀態時，外周血內的ctDNA 水平較低，通常為3～63 ng/mL，而當機體出現腫瘤時，由于循環癌細胞發生壞死和凋亡，將會導致血液內的DNA 水平明顯升高，從而使ctDNA 水平明顯高于健康人群，其濃度通常可達到122～462 ng/mL[13]。

相較于傳統影像學檢查和組織學檢查，CTCs 檢測和ctDNA 檢測的敏感性更高，可重復性好。在對CTCs實施檢測時，需做好細胞檢測與富集工作，可應用的檢測方法種類多，包括細胞檢測、流式細胞檢測、核酸檢測與免疫細胞化學檢測，富集方法包括黏附分離法、密度梯度離心法與免疫磁珠分離法。本研究結果顯示，對照組CTCs 均為陰性，ctDNA 水平為(28.1±4.3)ng/mL，觀察組CTCs陽性率與ctDNA水平明顯高于對照組。有資料報道稱，對于早期乳腺癌患者而言，其能夠從輔助治療中受益的比例達到接近30%，而對于晚期轉移乳腺癌患者而言，也可在其機體外周血內檢測到CTCs，因此通過對患者的CTCs 進行檢測，可為患者的疾病分期提供參考。本次研究結果顯示，M1期乳腺癌患者的CTCs陽性率明顯高于M0期乳腺癌患者，同時CTCs陽性率在不同TNM分期乳腺癌患者中也具有明顯差異化。

本研究結果顯示，不同年齡與病理類型乳腺癌患者的CTCs 陽性率與ctDNA 水平無明顯差異；不同乳腺癌TNM 分期患者CTCs 陽性率與ctDNA 水平具有明顯差異。提示隨著乳腺癌分期的改變，患者機體內的CTCs 陽性率與ctDNA 水平會出現明顯變化，因此通過對CTCs 陽性率與ctDNA 水平進行檢測，可為患者的疾病分期提供一定參考，從而可使患者的疾病治療更具有針對性。同時有資料報道稱，在腫瘤療效評估中CTCs 也可發揮一定價值，相較于ctDNA，CTCs檢測可對完整的腫瘤細胞進行提供，可采用多種RNA、DNA 與蛋白質組學測量方法，對癌癥過程進行全面了解[14-15]。但CTCs 的應用過程中存在稀釋以及分離困難等情況，因此當患者的疾病處于早期階段時，難以在血漿中發現CTCs，當患者的疾病發生轉移后，血漿中的CTCs 數量才會明顯增加，從而也使得CTCs 的檢測應用受到一定限制[16]。同時有資料報道稱，CTCs與匹配腫瘤細胞間具有一定差異，因此也可能對其分子生物學特征的可靠性產生一定影響[17]。因此在檢測過程中，將CTCs與ctDNA進行聯合應用，可有效提升診斷的準確性和可靠性[18]。

綜上所述，CTC與ctDNA檢測可為乳腺癌的診斷提供有效參考，可作為乳腺癌臨床診斷的有效指標。