人腦膠質瘤組織PI3K蛋白的表達及其與臨床病理特征的關系*

吳國敏，馮玲，楊宇石，史珂蔓，徐澍** ，李珀**

(1.貴州醫科大學 口腔醫學院 口腔組織病理學教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 臨床醫學院 病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，高居顱內腫瘤死亡率的第一位，已被公認是人類的一大健康殺手，膠質瘤治療主要是手術切除加輔助放療和/或化療，然而即使術后行放化療等綜合治療手段，患者仍然容易出現復發、耐藥或轉移[1]。有研究發現，人類腫瘤的發生發展是一個多基因多步驟的過程，腫瘤的復發惡變可由一條或者多條信號轉導通路介導[2-3]。近年來，磷脂酰肌醇3′-激酶信號(phosphatidylinositol 3′-kinase，PI3K)通路成為了研究腫瘤發病機制的熱點，其在肝癌、肺癌、白血病、胰腺癌、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中均有報道[4-8]，然而該通路與人腦膠質瘤發生、發展的關系及其機制尚少見報道。因此，本研究采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(immunohistochemical streptavidin-peroxidase technique，SP)檢測PI3K蛋白在人腦膠質瘤組織中的表達，同時觀察不同性別、年齡、腫瘤發生部位及分級等不同臨床病理參數患者的PI3K蛋白的表達差異，以期為研究膠質瘤的發生機制提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源及分組 收集未經化療的膠質瘤患者的腦組織腫瘤存檔蠟塊作為實驗組，要求均為首次診斷且有完整的臨床資料(包括性別、年齡、家族史及腫瘤發生部位等)，確診采取雙盲法按照修訂的第4版《WHO中樞神經系統腫瘤分類》[9]對膠質瘤的分類和分級。實驗組納入膠質瘤患者45例，男性23例、女性22例，年齡<40歲29例、≥40歲16例，腫瘤發生于腦葉者34例、深部者11例，病理分級低級別(Ⅰ～Ⅱ級)30例、高級別(Ⅲ～Ⅳ級)15例；另取25例腦血管病患者的正常腦組織存檔蠟塊作為對照組，男性19例、女性6例，年齡<40歲14例、≥40歲11例。實驗組與對照組患者性別及年齡分布差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要試劑和儀器 免抗人單克隆PI3Kp110α抗體、免抗人單克隆PI3Kp110β抗體及免抗人單克隆PI3Kp85抗體(南京沃爾森)，免疫組化超敏反應試劑盒、載玻片、乙二胺四乙酸二鈉修復液(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt antigen retrieval solution，EDTA)、二氨基聯苯胺顯色試劑盒(3,3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB)及磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(山東邁新)；AxioLab.A1高清顯微鏡(Carl Zeiss)，HM325輪轉式切片機(Thermo)，GeminiAS全自動染色機(Thermo)，ClearVue自動封片機(Thermo)，RHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(中威)，ZYTEST-Ⅰ-40L超純水機(卓越)及101-1AB電熱鼓風恒溫干燥箱(泰斯特)。

1.2方法

1.2.1蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)判斷膠質瘤的病理分級 從石蠟包埋的樣本中切取厚度為3μm的組織切片，普通載玻片撈片，65 ℃烤片40 min，二甲苯脫蠟5 min/次、3次，梯度酒精后水化，經蘇木精染液染色8 min，水洗，1%鹽酸酒精分化30 s，水洗，碳酸鋰飽和液藍化2 min，水洗，95%酒精脫水后放入伊紅(醇溶性)染色液中染色1 min，95%酒精洗去多余染液；100%酒精脫水2 min/次、2次，二甲苯透明5 min，自動封片機中性樹脂封片。觀察鏡下細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，紅細胞呈橘紅色。

1.2.2PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白表達 采用SP法檢測，從石蠟包埋的樣本中切取厚度為3 μm的組織切片，65 ℃烤片60 min，三缸二甲苯依次脫蠟各10 min，梯度酒精后水化；采用EDTA高溫煮沸法進行抗原修復，應用3%過氧化氫去除切片的非特異性染色，然后每張切片滴加山羊血清50～100 μL封閉；將現配好的一抗(PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85均按說明書推薦比例稀釋)50～100 μL滴加在切片上，冰箱4 ℃過夜，第2天25 ℃復溫30 min，滴加二抗后置于37 ℃水浴箱孵育1 h，DAB顯色5～10 min，顯色時間以鏡下觀察到棕黃色或棕褐色顆粒為宜；蘇木素復染、分化、返藍、脫水、透明，最后經自動封片機用中性樹脂封片觀察。隨機選取10個高倍鏡(400×)視野，計數其中1 000個細胞，按著色強度無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色分別計為0、1、2及3分；計數隨機視野內細胞核或/和細胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒的細胞所占的比例，陰性為0分、≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、≥75%為4分；將染色強度和陽性細胞數得分乘積>3分判定為陽性表達，≤3分判定為陰性表達[10]。

1.3統計學方法

采用SPSS 25.0對數據進行統計學分析，計數資料采用頻數(n)、率(%) 表示，數據比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1HE染色

實驗組病理分級低級別膠質瘤的腫瘤細胞彌漫分布，分化良好，排列疏松，腫瘤細胞呈中等程度增加，異型性不明顯，無核分裂象，無壞死和微血管增生現象；而高級別膠質瘤的腫瘤細胞密度明顯增加，異型性明顯，核深染，核分裂象增多，可見怪異的瘤巨細胞，微血管增生，腫瘤浸潤范圍廣，可見出血壞死。對照組腦組織水腫，神經細胞變性及減少，局部區域膠質細胞增生，神經纖維空泡變。見圖1。

實驗組低級別膠質瘤 實驗組高級別膠質瘤 對照組腦組織 圖1 實驗組及對照組腦組織HE染色(200×)Fig.1 The brain tissues HE in the experimental group and control group microscopically (200×)

2.2PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白表達

實驗組及對照組腦組織細胞可見細胞質或細胞核中出現不同染色程度的棕黃色或棕褐色顆粒，少部分細胞胞核黃染，見圖2A；實驗組人膠質瘤腦組織PI3Kp110α、PI3Kp110β陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，但PI3KP85陽性表達率與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。

2.3實驗組PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白表達與臨床病理特征的關系

實驗組患者的不同性別、年齡、腫瘤發生部位及病理分級間的PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85陽性表達差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

3 討論

PI3K信號轉導通路即PI3K/蛋白激酶B(protein kinaseB，Akt)/和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號轉導通路，又稱PI3K/Akt/mTOR信號通路，主要參與調節細胞的生命活動，包括細胞增殖、活化及凋亡，是組織細胞生存及生長的調控中樞及網絡系統[11]。PI3K家族由3類同工酶組成，其中ⅠA型(class IA PI3K)是研究最為廣泛的一種，由PI3Kp110催化亞基(α，β和δ)和PI3Kp85調節亞基組成，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性[12-13]。PI3Kp110α和PI3Kp110β廣泛分布在哺乳動物組織中，PI3Kp110δ與之相反，分布較為局限，主要存在于白細胞[14]；正常情況下，PI3Kp85調節亞基抑制PI3Kp110催化亞單位活化PI3K，從而抑制PI3K/Aat/mTOR信號通路的活化[15]；PI3Kp85調節亞基是許多細胞胞質內的酪氨酸激酶受體及磷脂蛋白的作用對象，當細胞胞質外相應的配體與此受體相聯合后,受體被活化，PI3Kp110和PI3Kp85聚合的二聚體產生變化，從而使PI3Kp85對于PI3Kp110的克制作用被解除，PI3K被迅速激活，所以PI3K可以被許多包含酪氨酸激酶受體、非酪氨酸激酶受體及胰島素受體等細胞胞外信號受體所激活[16]；受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)不僅能激活PI3K系統，也能激活Ras激酶系統，進一步來說，Ras激酶亦可結合PI3Kp110催化亞基并使之同步激活，最后導致PI3K信號轉導通路激活[17-18]。通過多年研究，人們已發現PI3K擁有3個輔酶，可以催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)的3號位羥基被磷酸化，即催化產生磷脂酰肌醇4,5二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate,PIP2]及3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇 (phosphatidyl inositol triphosphate，PIP3)[19]。PIP2和PIP3是細胞內重要的第二信使，能激活下游一系列蛋白激酶如PKA(protein kinase A)、Akt/PKB(protein kinase B)及PKC(protein kinase C)，從而進一步往下傳輸信號[20]。PI3K信號轉導通路對細胞的繁殖、轉移、轉運以及凋亡、惡變進程中的多種病理及生理程序起著至關重要的作用[21]。近年來，PI3K/Akt/mTOR信號通路成為研究腫瘤發病機制的焦點，有報道發現PI3Kp110α和PI3Kp110β在鼻咽癌、卵巢癌等多種實體腫瘤中出現高表達[22-23]。本研究結果表明，實驗組PI3Kp110α、PI3Kp110β陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，這與以往的研究結果一致，因此有理由認為PI3K與膠質瘤發病機制密切相關，PI3K異?；罨笸ㄟ^PI3K信號通路促進了膠質瘤的發生；但實驗組PI3KP85陽性表達率低于對照組，差異無統計學意義(P>0.05)，這與以往的研究不同[24-25]，還需進一步擴大樣本進行驗證。此外，本研究分析不同性別、年齡、腫瘤發生部位及病理分級患者的膠質瘤組織PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85陽性表達差異均無統計學意義(P>0.05)，與徐余超[26]研究相似，與Sun等[27]結果部分相似，故可以認為PI3K蛋白陽性表達與膠質瘤患者的臨床病理特征無關，可能存在其他因素(如復發、轉移等)，從而提示了以后的研究方向。

注：A為SP法檢測各蛋白結果(箭頭表示陽性表達細胞)，B為各蛋白陽性表達率的條圖；(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 實驗組及對照組腦組織中PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白的表達(SP，×400)Fig.2 Expression of PI3Kp110α，PI3Kp110β and PI3KP85 in brain tissues of the experimental group and the control group (SP，×400)

表1 實驗組PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85的陽性表達與臨床病理特征的關系[(n)%])Tab.1 Relationship between clinicopathological parameters and the expression of PI3Kp110α，PI3Kp110β and PI3KP85 in the experimental group[(n)%]

綜上所述，本研究表明PI3K蛋白在人腦膠質瘤組織中存在過度表達，但該表達與膠質瘤患者的臨床病理特征無關。