柯薩奇病毒B組2型SYBR Green I RT-PCR檢測方法的建立*

楊亞平，段素琴，楊鳳梅，李艷艷，劉權，劉雨，趙遠，馬紹輝，和占龍

(中國醫學科學院 &北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南 昆明 650118)

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一類由人腸道病毒(human enterovirus,HEV)感染引起的流行性傳染病，多發生于5歲以下嬰幼兒，可引起嚴重的中樞神經系統損傷和心肺衰竭等癥狀[1-2]，2008年5月HFMD被納入我國法定報告的丙類傳染病[3]。近年來，HFMD引起的病例呈高發態勢，嚴重危害嬰幼兒健康和生命安全，給家庭帶來沉重的疾病和經濟負擔[4]。目前，我國對HFMD的監測主要集中在腸道病毒71型(enterovirus A71,EVA71)、柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16,CVA16)、柯薩奇病毒A組10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯薩奇病毒A組6型(coxsackievirus A6,CVA6)，對其他腸道病毒的分型鑒定尚不多，但近年來其他腸道病毒比例有所升高[5]；此外，引起HFMD的病原譜構成呈多樣化和復雜化[6]。柯薩奇病毒B組2型(coxsackievirus B2，CVB2)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬B組[7]。流行病學調查顯示，CVB2是引起兒童HFMD的病原體之一[8]，CVB2還會引起心肌炎和無菌性腦膜炎[9-10]，嚴重者可導致多器官感染[11]，尤其是病毒性心肌炎常見的原因[12-13]。目前,對于病毒性心肌炎的臨床診斷，主要依據臨床癥狀、生化檢查和心電圖[14-15]，但由于病毒性心肌炎發病初期癥狀不典型，出現臨床癥狀時往往已經累及心肌，引起心肌不可逆轉的損傷，嚴重危害健康[16]。由于目前有關CVB2檢測方法的報道甚少，為了加強對CVB2引起的HFMD的監測及預防，因此本研究擬建立檢測CVB2的SYBR Green I逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，為CVB2的快速診斷和流行病學調查提供快捷、有效的分子檢測手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒 CVB2(RW41-2/YN/CHN/2012)、CVA6及CVA10病毒由中國醫學科學院醫學生物學研究所遺傳室馬紹輝課題組惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 JM109感受態細胞、pMDTM19-T Vector Cloning 、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、AxyPrep DNA Gel Recovery Kit、in vitro Transcription T7 Kit、One Step TB Green?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit及DNA A-Tailing Kit 均購自大連寶生物工程有限公司，TIANpure Midi Plasmid Kit購自天根生物有限公司，C1000型 PCR 儀、C1000 TouchTM Thermal Cycler實時熒光定量PCR儀及凝膠成像自動分析儀均購自美國BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成 利用GenBank中CVB2毒株(RW41-2/YN/CHN/2012)的病毒衣殼蛋白1(virus protein 1,VP1)基因序列，通過MEGA7.0軟件對本毒株和GenBank中其他CVB2基因序列比對，之后利用Primer5.0軟件設計引物(表1) ，由上海生工生物工程(股份)公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2制備標準品 用Trizol法提取病毒RNA，采用RT-PCR擴增的方法，用PCR引物VP1-F和VP1-R特異性擴增875 bp的CVB2 DNA片段；用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit純化PCR產物，利用DNA A-Tailing試劑盒和pMDTM19-T Vector Cloning試劑盒對純化后的PCR產物進行末端加A與載體連接，形成T-A連接產物；將連接產物轉化至JM109感受態細胞，用藍白斑試驗篩選重組質粒，挑取白色菌落轉接至含有氨芐的LB培養液中，37 ℃、200 r/min。酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的片段的3 572 bp瓊脂糖凝膠，用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit純化后進行體外轉錄,體外轉錄用In vitro Transcription T7 Kit體外轉錄獲得模板RNA。于室溫下采用20 μL體系：10×緩沖液2 μL,腺嘌呤核糖核苷三磷酸(adenine ribonucleoside triphosphate，ATP)、鳥嘌呤核糖核苷三磷酸(guanine ribonucleoside triphosphate，GTP)、胞嘧啶核糖核苷三磷酸(cytosine ribonucleoside triphosphate，CTP)及尿嘧啶核糖核苷三磷酸(uracil ribonucleoside triphosphate，UTP)各2 μL，T7 RNA Polymerase 0.5 μL，核酸酶抑制劑2 μL，線性化質粒50 ng，去離子水補足至20 μL，37 ℃、3 h，轉錄產物加RNase free DNase I(1 U/L)0.2 L，37 ℃、30 min，用苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀轉錄RNA，采用紫外分光光度計測定RNA濃度，計算標準品的拷貝數[17]。

1.2.3RT-PCR反應體系優化及檢測方法評價 (1)優化反應體系，在相同模板量與反應體系中，采用矩陣法優化引物濃度，即以無引物二聚體產生、背景噪音小、熒光信號強等為判斷標準，確定引物的最佳濃度；(2)建立標準曲線，以10倍梯度稀釋CVB2病毒VP1重組質粒的體外轉錄標準品，取濃度102～109拷貝/μL標準品稀釋液8個梯度，進行SYBR Green I RT-PCR反應，同時設立陰性對照，制作標準曲線；(3)特異性檢測，利用優化的SYBR Green I RT-PCR檢測體系對CVB2、CVA6、CVA10、CVA16及EV71的病毒核酸進行檢測，評價方法的特異性；(4)靈敏性檢測，將CVB2的標準品按10倍梯度稀釋(100～109拷貝/μL)，使用建立的SYBR Green I RT- PCR方法進行檢測，評價其對病毒核酸檢測的靈敏性；(5)重復性檢測，分別制備不同濃度梯度的標準品(103、106及109拷貝/μL)，同時進行SYBR Green I RT-PCR，每個標準品做3個重復，觀察組內重復性；對上述不同濃度的標準品分別做獨立的SYBR Green I RT-PCR檢測，同樣做3個重復，觀察組間重復性。

1.3統計學分析

2 結果

2.1CVB2特異性片段VP1的擴增

CVB2擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，700～1 000 bp見一條特異性條帶，大小與預期一致，見圖1A；重組質粒pMD19-T-CVB2經Xbal酶切后，3 572 bp出現一條清晰的條帶，與預期相符，見圖1B；用測定的重組質粒序列與GeneBank數據庫中的CVB2株(RW41-2/YN/CHN/2012)的基因序列進行序列比對，同源性為99.77%。

注：A為CVB2的VP1片段，B為酶切后的重組質粒；M表示DNA marker ，1～3表示3個重組質粒。圖1 RT-PCR產物電泳及重組質粒的酶切產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of RT-PCR products and recombinant plasmids after enzyme

2.2反應體系優化

經矩陣法優化后最佳引物終濃度為300 μmol/L，SYBR Green I RT-PCR反應體系及各試劑使用量為：2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 10 μL、TaKaRa Ex Taq HS Mix 1.2 μL、PrimeScript PLUS RTase Mix 0.4 μL、RNase free dH2O 5.2 μL、q-RT-PCR-F/R(10 μmol/L)各0.6 μL、模板2 μL。反應條件為42 ℃、5 min，95 ℃、10 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40次循環。

2.3檢測方法的評價

2.3.2特異性評價 該方法檢測CVB2為陽性，CVA6、CVA10、CVA16及EV71無熒光擴增曲線，提示該方法特異性較強，見圖2D。

注：A為擴增曲線，B為熔解曲線，C為標準曲線，D為特異性檢測。圖2 SYBR Green I RT-PCR標準曲線的建立和特異性檢測Fig.2 Establishment and specific detection of SYBR Green I RT-PCR standard curve

2.3.3靈敏性評價 該方法檢測標準品在102～109拷貝/μL時，可出現較好的擴增曲線，建立的SYBR Green I RT-PCR方法的最低檢測限為102拷貝/μL。

2.3.4重復性評價 對不同濃度梯度的標準品(103、106及109拷貝/μL)各進行3次組間和組內重復性實驗，結果顯示組內及組間CV均<1%，見表2。

表2 SYBR Green I RT-PCR重復試驗Tab.2 Repeated test results of SYBR Green I RT-PCR

3 討論

近年來CVB2病毒感染引起手足口病的報道逐漸增多，建立一種簡單快速、特異性強及靈敏性高的檢測方法對于手足口病病原的檢測和分型有重要意義[18]。HFMD相關病原體的檢測方法有病毒分離和血清學診斷，前者是診斷病毒性疾病的金標準，但檢測周期較長，敏感性較低；后者雖快速，但操作繁瑣，費時費力且易出現假陽性、假陰性的問題[19]。目前，HFMD病原體常用檢測技術有RT-PCR、實時熒光PCR探針法、環介導等溫擴增技術和基于毛細管電泳芯片的激光誘導熒光檢測系統[20-23]。但這些方法需用昂貴的熒光探針或需要引物和復雜的設備，而SYBR Green I 染料法不需要熒光探針，并且設備簡單[24]。SYBR Green I 染料法中的染料與雙鏈DNA結合后使熒光增強1 000倍左右，并能對PCR擴增產物進行連續的檢測，通過溶解曲線判斷引物是否有特異性，通過熔解溫度有效區分特異性產物、非特異性產物及引物二聚體[25]。同時，該方法檢測樣品簡便快捷，無需凝膠電泳且可實時觀察結果，大大節省了時間[26]。呂莉琨等[27]應用該方法對柯薩奇病毒A組的3個基因型進行了分型鑒定。當然SYBR Green I RT-PCR檢測方法自身也有不足之處：如無法檢測擴增產物的大小，因各實驗室所用的標準曲線的標準品不一致，可能會使結果缺乏可比性等，隨著對檢測方法的進一步優化，這些問題都將能得到改進[28]。

本研究以CVB2的保守基因片段作為RNA標準品制備的模板，以保證實驗檢測的準確性。在擴增合成VP1標準品RNA的DNA模板時，在用以擴增VP1的上游引物的5′端加了T7啟動子，之后在體外對重組質粒的VP1片段進行轉錄。該方法從技術上避免了用載體合成RNA的缺點，同時利用試劑盒體外轉錄的RNA，可以避免交叉污染，減少生物安全風險。本研究構建的含有T7啟動子的CVB2的重組質粒，經體外轉錄、精制獲得的RNA用做標準品，將標準品梯度稀釋后經優化后的反應體系獲得的熔解曲線單一，曲線平穩且無非特異性溶解峰，可對CVB2實現特異性擴增。同時，利用標準品建立的標準曲線在102～109拷貝/μL范圍內具有良好的線性關系，最低檢測限度 102拷貝/μL，R2為0.996，擴增效率 102.2%；對EVA7、CVA16、CVA10和CVA6均無交叉反應，組間和組內的CV均小于1%。

綜上所述，本實驗建立的檢測CVB2的SYBR Green I RT-PCR方法具有良好的靈敏性、特異性和重復性，可用于CVB2毒的快速檢測和定量分析。