雷帕霉素改善血管性癡呆小鼠認知功能的機制*

陳麗，楊帆，趙志紅，秦潔

(天津市環湖醫院 神經內科，天津 300060)

研究發現，慢性缺血缺氧、低灌注是血管性癡呆(vascular dementia，VaD)的最主要的原因。長期的慢性低灌注改變了腦內的微環境，導致小膠質細胞的激活，一項全基因組關聯研究(GWAS)進一步確定了小膠質細胞狀態與癡呆的新關聯[1-3]，提出小膠質細胞導致腦內微環境功能失調可能是癡呆病理生理學基礎。在慢性缺血老化的腦組織中，小膠質細胞可表現出多種表型，在維持腦內環境穩態中發揮著雙重作用[4-5]。小膠質細胞可以極化成M1前炎癥狀態，釋放前炎癥因子如白細胞介素6 (interleukin 6，IL-6) 及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)；亦可呈M2抗炎狀態，通過IL-4、精氨酸1(arginine-1，Arg-1)、IL-10和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)緩解炎癥和組織修復。雷帕霉素(rapamycin)為免疫抑制劑，可通過抑制mTOR通路達到控制免疫反應的作用，研究表明mTOR可以改變免疫細胞的活化及分化[6-8]。本研究采用雙側頸總動脈縮窄(bilateral common carotid artery stenosis,BCAS)法制作VaD 模型，采用雷帕霉素治療，探討雷帕霉素是否可以通過調節長期慢性低灌注腦組織中M1/M2的平衡、重建腦內微環境的穩態，改善認知功能，報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 20只成年健康雄性C57BL/6J小鼠，12周齡，體質量30～35 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。該研究方案提交醫學倫理部門審核，符合相關倫理學要求。

1.1.2主要試劑和耗材 CD16/32一抗購自美國Abcam公司，Iba1 一抗購自美國Abcam公司，CD206 一抗購自Millipore公司，熒光標記抗兔二抗購自美國Abcam公司，抗羊二抗購自Invitrogen公司，DAB顯色劑購自北京中衫金橋生物技術有限公司，枸櫞酸鹽緩沖液購自北京中衫金橋生物技術有限公司，4%多聚甲醛購自武漢博士德生物技術有限公司，牛血清白蛋白購自美國Sigma公司，10%水合氯醛購自天津醫藥集團上海化學試劑公司。

1.2方法

1.2.1實驗模型制備 20只小鼠采用BCAS制作VaD模型，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射將小鼠麻醉，仰臥位，將其固定在解剖手術臺上，備皮、消毒；行頸部前正中切口，鈍性分離組織，保護迷走神經，暴露兩側頸總動脈，采用內徑為0.18 mm微線圈進行BCAS[9]，確認無滲血，縫合切口，并消毒；術后注意保溫，待動物蘇醒后單籠飼養，流質飲食，密切觀察。

1.2.2VaD模型的入選標準 考慮到手術本身對小鼠的影響，本研究在預實驗中選用成年健康雄性C57BL/6J小鼠兩測頸總動脈進行僅穿線不結扎處理作為假手術組，對假手術組和VaD組存活的小鼠進行水迷宮測試，參考文獻[10]觀察造模情況。結果顯示，假手術組小鼠平臺逃避潛伏期在第3天～第5天較VaD組明顯縮短(P<0.05)，提示VaD模型小鼠有認知功能障礙，模型制備成功。

1.2.3給藥方法 本研究于建立模型后2周將VaD小鼠隨機分成VaD組及治療組，每組10只，參考文獻[11]治療組給予2.24 mg/kg的雷帕霉素灌胃，VaD組分別給予與治療組相同體積的PBS灌胃，治療4周。

1.2.4Morris水迷宮行為學實驗 于灌胃4周時，利用Morris水迷宮檢測VaD組及治療組小鼠空間記憶能力。(1)定位航行試驗：將小鼠于第1象限入點處面向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內尋找并爬上平臺的時間，即逃避潛伏期，之后分別從其他3個象限入水點將鼠放入水中，連續訓練5 d。(2)空間探索試驗：于第6天撤去平臺，在第1象限入點處將小鼠放入水中，記錄小鼠在60 s內的運動軌跡，計算其在原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比及通過目標象限的次數。

1.2.5組織學觀察 Morris水迷宮結束后，麻醉處死小鼠，獲得海馬組織標本，常規固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀切片，再脫蠟、水化；蘇木素染色5 min，自來水沖洗2 min，鹽酸乙醇酸化30 s(提插數下)，自來水浸泡15 min或溫水(約50 ℃)5 min，置伊紅液染色2 min，常規脫水，透明，封片，觀察其組織學改變。

1.2.6腦組織切片Tunnel染色 脫蠟、水化，用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95 ℃加熱20 min進行抗原修復，置于冰丙酮溶液中固定破膜7 min，用PBS洗5 min×3次，滴加Tunnel反應混合物50 μL，在濕盒中4 ℃孵育60 min，洗脫，使用DAB顯色套裝進行顯色，觀察Tunnel陽性細胞數量。

1.2.7小膠質細胞表型標志性產物基因表達水平 采用逆轉錄實時定量熒光PCR(RT-qPCR)檢測小膠質細胞M1表型標志性產物基因(CD16、iNOS及TNF-α)及M2表型標志性產物基因(IL-10、TGF-β及Arg1)的表達，引物由上海生工生物技術有限公司合成(引物序列見表1)，根據操作說明方法用Trizol提取海馬組織總RNA，然后用定量逆轉錄試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)合成cDNA ，用Syber Green 熒光定量 PCR 檢測，反應總體系20 μL，PCR 熱循環參數為96 ℃ 4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，行40個循環。以β-actin為內參照基因，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值統計分析。

表1 RT-PCR目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8海馬mTORC1通路相關蛋白P-Akt和P-p70s6k表達 采用Western blot法檢測，稱取海馬標本200 mg，按1 mg ∶10 μg的比例加入樣本和蛋白裂解液，用勻漿30 s、共3次，冰上靜置裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，留取上清進行蛋白定量；其余上樣、電泳、轉膜，用膜封閉液P-p70S6k (1 ∶1 000)、p-Akt (1 ∶1 000及β-actin (1 ∶5 000)一抗，4℃輕搖過夜。用TBST按照1 ∶5 000稀釋相應的二抗，以β-actin作為內參照檢測P-Akt和P-p70 S6k表達。

1.3統計學分析

2 結果

2.1行為學實驗

結果顯示，治療組小鼠第3～5天的逃避潛伏期時間較VaD組顯著縮短，差異有統計學意義(P<0.05)，提示雷帕霉素可改善長期慢性腦缺血引起的認知障礙，具有神經保護作用。第6天空間探索實驗結果顯示，治療組小鼠穿過目標象限時間及通過目標象限次數顯著高于VaD組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示雷帕霉素對VaD的認知功能具有改善作用。見圖1。

2.2海馬區HE及Tunnel染色

HE染色結果顯示，VaD組可見海馬區細胞層數及數量減少、細胞排列紊亂、神經細胞呈缺血樣改變，可見神經細胞壞死、神經元外形不易辨認，可見核固縮、深染，胞漿內容物減少，結構疏松，伴有細胞壞死及炎性細胞的浸潤；治療組細胞層數及數量基本正常，細胞排列相對清晰，僅少量神經細胞可見核固縮、深染，無明顯的空泡樣改變；提示雷帕霉素能夠改善長期慢性腦缺血引起的腦組織病理變化，對VaD有保護作用(圖2A)。Tunnel結果顯示，治療組Tunnel陽性細胞數量較VaD組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05，圖2B-C)，提示雷帕霉素能夠明顯減少海馬區神經細胞的凋亡，可能是改善VaD小鼠的認知障礙的機制。

注：(1)與VaD組比較，P<0.05。圖1 2組小鼠水迷宮實驗結果Fig.1 The effect of rapamycin on behaviors of mice in two groups

注：A為HE染色，B為Tunnel染色，C為Tunnel染色陽性細胞數;(1)與VaD組比較，P<0.01。圖2 2組小鼠海馬CA1區HE染色及Tunnel染色結果(200×)Fig.2 The effect of rapamycin on cellular structure and apoptosis in CA1 area of mice in two groups(200×)

2.3小膠質細胞表型標志性產物基因表達

RT-qPCR結果顯示，與VaD組比較，治療組小鼠海馬組織M1表型標志性產物基因(CD16、iNOS及TNF-α)表達顯著降低，M2表型標志性產物基因(IL-10、TGF-β及Arg1)表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；提示雷帕霉素抑制了海馬組織的前炎癥反應，促使海馬區炎癥因子內環境由M1向M2轉變。見圖3。

2.4mTORC1通路相關蛋白表達

Western blot結果顯示，與VaD組比較，治療組小鼠海馬區P-Akt蛋白的表達水平顯著升高、P-p70s6k蛋白表達水平顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)；提示雷帕霉素抑制P-p70s6k的表達，同時反饋性地降低了對P-Akt的抑制。見圖4。

3 討論

本研究從行為學、形態學和分子生物學3個不同角度，驗證了雷帕霉素通過減輕微環境中的炎癥反應和調節小膠質細胞M1/M2的平衡對腦缺血損傷長期慢性低灌注導致VaD起保護作用。為了研究認知功能，本研究采用水迷宮試驗對VaD組及治療組進行比較，發現雷帕霉素能明顯改善VaD小鼠的認知功能。研究報道，BCAS能導致小鼠顱內三分之一的血流量減少[12]，尤其是海馬CA1區[13]，于是本研究通過HE染色觀察發現雷帕霉素能夠改善長期慢性腦缺血引起的腦組織的病理變化，進一步通過Tunnel染色發現雷帕霉素能夠明顯減少海馬區神經細胞的凋亡，從而改善VaD小鼠的認知障礙。VaD疾病的病理過程極為復雜，其發病機制涉及多個環節，其中小膠質細胞的活化在認知障礙的發病機制中起著越來越重要的作用[5,14]。小膠質細胞M1代表促炎狀態，誘導組織內神經元損傷擴大；相反，M2 具有較強的吞噬和清除壞死或凋亡神經元碎片的能力，以避免繼發性炎癥反應，促進組織再生[15-16]。于是實驗采用CD16、iNOS及TNF-α作為M1標記，用IL-10、TGF-β及Arg1作為M2標記進行研究，結果發現治療組M1炎癥標記物產物基因相對表達量較VaD組顯著下調，M2炎癥標記物產物基因相對表達量顯著上調，提示雷帕霉素抑制了海馬組織的前炎癥反應，促使海馬區炎癥因子內環境由M1向M2轉變。小膠質細胞在腦缺血應激的極化分型對減輕VaD的炎癥反應及促進神經細胞的修復起著重要的作用，適當調控小膠質細胞M1/M2的平衡對腦缺血損傷的預后具有保護作用。大量研究表明mTOR通路在細胞生長、分化、轉移和存活中起著核心地位，對生長因子、營養物質及機體能量狀態等產生應答,從而調節細胞生長、增殖、自噬、代謝及調控細胞周期等[17]，此外，mTOR還具有調節免疫細胞分化、活性和功能的作用[18-19]，抑制mTOR通路可以調控小膠質細胞M1/M2的極化狀態，從而維持內環境的穩態[7]。雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以延長壽命，減緩許多與衰老相關的疾病，比如阿爾茨海默病、帕金森病及運動神經元病等[20-22]。本研究證實了雷帕霉素對VaD的發病及進展也具有一定的延緩作用。值得注意的是，有研究表明通過抑制mTORC1可以降低Akt，從而選擇性抑制IRE1α/JNK/NF-κB途徑，有效降低炎癥反應[23-25]，本研究進一步印證了mTORC1-Akt這一反饋環路，雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路從而降低下游產物P-p70S6K的表達，P-p70S6K的減少又反饋性促進p-Akt的激活，從而抑制的炎癥，使M1向M2轉化。

注：與VaD組比較，(1)P<0.05，(2) P<0.01。圖3 2組小鼠海馬區M1/M2表型標志性基因表達Fig.3 The effect of rapamycin on the mRNA expression levels of M1 and M2 markers of mice in two groups

注：與VAD組比較，(1)P<0.05，(2) P<0.01。圖4 2組小鼠海馬區mTORC1通路蛋白表達Fig.4 The effect of rapamycin on P-Akt and P-p70S6k expression of mice in two groups

綜上所述，本研究發現，長期慢性缺血缺氧狀態下所致的VaD小鼠海馬區小膠質細胞激活，打破了M1/M2平衡，導致大量神經元壞死，從而降低了小鼠的學習和記憶能力，雷帕霉素通過抑制mTORC1通路調節M1/M2穩態，從而有效減輕慢性腦灌注不足引起的認知功能障礙，這為VaD的治療提供了一定的實驗依據。