VPS13A基因突變致舞蹈病-棘紅細胞增多癥的診斷及家系研究*

姚念廷，鄭乾，馮占輝，尹建紅，徐子茜，焦玲*，張春林

(1.貴州醫科大學附院 神經內科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550004)

舞蹈病—神經棘紅細胞增多癥(chorea-acanthocytosis,ChAc)是一種臨床罕見的以舞蹈樣動作和外周血棘紅細胞增多為典型特征的神經系統退行性疾病，臨床表現主要為口、舌、面不自主運動、進行性舞蹈樣運動障礙、精神癥狀、認知功能下降以及其他多系統損害[1]。該病臨床表現形式多樣，可累及運動、神經、精神以及內分泌等全身多個系統[2-6]，與麥克勞德綜合征(mcLeod neuroacantho cytosis syndrome，MLS)、類亨廷頓病2型(huntington’s disease-like 2，HDL2)、泛酸激酶相關的神經退行性(pantothenate kinase—associated neurodegeneration，PKAN)等疾病的臨床癥狀、實驗室檢查及影像學表現上存在較多的重疊，其臨床診斷比較困難[7]。目前ChAc還沒有具體的診斷標準，但ChAc的早期診斷至關重要，外周血棘紅細胞是該病的重要特征性的診斷依據，而分子生物學及基因檢測是ChAc診斷的金標準[8-10]。ChAc是常染色體隱性遺傳疾病[5,7,11]，液泡蛋白分類同源物13A(vacuolar protein sorting homolog 13A,VPS13A)基因是目前唯一與ChAc相關的致病基因[10,12]，目前已報道VPS13A基因突變形式多樣化，包括錯義突變、無義突變、移碼突變、缺失或插入突變等，這些不同類型的突變增加了ChAc遺傳診斷復雜性[5,13]。因ChAc為十分罕見的遺傳病，故本研究通過收集的1例疑似ChAc病例及其家系的臨床資料，同時利用掃描電鏡檢測外周血棘紅細胞及全外顯子目標序列捕獲2代測序技術鑒定其基因突變點，探討ChAc的診斷方法，為ChAc的精準診斷提供可行合理的策略，以期避免誤診或漏診。

1 對象和方法

1.1研究對象、主要試劑和儀器

1.1.1研究對象 收集某院1例臨床表現疑似ChAc先證者及其家系資料，其中先證者符合以下ChAc診斷標準[5]，即肢體舞蹈樣動作，口周和(或)口下頜肌張力障礙及進食性肌張力障礙，口唇自噬動作，顱腦MRI可見尾狀核頭萎縮，血生化提示肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)均升高。先證者(Ⅱ3)29歲、男性、漢族、既往體健，先證者父親(Ⅰ1)57歲、漢族，先證者母親(Ⅰ2)55歲、漢族，先證者哥哥(Ⅱ1)35歲時去世、漢族，先證者姐姐(Ⅱ2)32歲、漢族。

1.1.2主要試劑和儀器 2.5%戊二醛固定液(上海釜誠生物科技有限公司)，0.1 mol/L PBS緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)，50%、70%、80%、90%和100%酒精(北京柏奧易思生物科技有限公司)，標準文庫構建試劑盒(北京邁基諾基因科技股份有限公司)，DNA 提取試劑盒(德國Qiagen公司)，Illumina標準測序試劑盒(美國NEB公司)；XL-30掃描電鏡(荷蘭PHILIPS公司)，BAL-TEC SCD離子濺射儀(瑞士BAL-TEC公司)，Covaris S2超聲儀(美國Covaris公司)，ABI 3730XL測序儀(美國應用生物系統公司)，Nanodrop 2000 樣本定量檢測儀(美國Thermo Fisher科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1先證者臨床信息 收集先證者基本臨床資料、實驗室和影像學結果，詢問并記錄家系情況并繪制家系圖。

1.2.2電鏡檢查 提取先證者保留外周靜脈血1～2滴加入5 mL新鮮配制的質量分數2.5%戊二醛固定液中，輕輕振蕩后靜置于4 ℃冰箱0.5 h，取適量已固定好血樣置于1.5 mL離心管，1 500 r/min低速離心15 min去上清，0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3次、5 min/次，體積分數50%、70%、80%、90%及100%酒精(2次)脫水，加入適量無水乙醇混勻，滴于潔凈蓋玻片上，室溫自然干燥；用雙面膠帶將干燥后的蓋玻片粘貼在樣品臺上，利用BAL-TEC SCD離子濺射儀噴金，利用PHILIPS XL-30掃描電鏡觀察棘紅細胞。

1.2.3篩查致病基因 (1)DNA提取、基因組文庫構建、基因的捕獲及高通量測序：提取先證者保留外周靜脈血2 mL，使用基因組DNA提取試劑盒對樣本DNA進行核酸提取；取先證者的DNA 3 μg稀釋，采用Covaris S2超聲儀進行超聲片段化(大小150 bp)；用標準文庫構建試劑盒制備全基因組文庫，用Nanodrop 2000樣本定量檢測儀進行質控；采用GenCap技術(北京邁基諾基因科技有限責任公司)捕獲目的基因，用Illumina NextSeq 500進行測序。(2)數據篩選和生物信息學分析：目標區域測序后，去除測序數據中的接頭和低質量數據 (質量值≤20) ，運用BWA軟件比對參考基因組，用GATK軟件對各個樣本的比對數據進行多態性位點的檢測，對單核苷酸多態性( single nucleo- tide polymorphisms，SNPs)和插入缺失突變 (InDels)等數據進行統計和分析；同時進行測序深度、均一性、探針特異性等數據的統計分析；查找SNPs及In-Dels 在千人基因組(http://www.1000genomes.org/)及dbSNP132(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pro-jects/SNP/)數據庫中頻率，利用PolyPhen-2軟件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)進行SNPs及InDels 致病性分析。(3)Sanger測序驗證：根據需要測序的DNA片段合成引物，用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)法進行擴增，用ABI 3730xl 測序儀以Sanger測序法進行測序，測序結果與目標區域捕獲測序后的結果進行比對。

2 結果

2.1先證者的臨床資料和家系圖

先證者(Ⅱ3)，29歲男性，因“進行性口面部、四肢不自主運動2+年，加重半年”于2018年11月22日入院。2+年前先證者無明顯誘因逐漸出現伸舌、磨牙、扮鬼臉、頭部擺動及四肢舞蹈等不自主動作，伴反復下唇咬傷、潰瘍，近半年癥狀逐漸加重，伴吞咽困難，無法進食。神經系統查體：言語欠流暢、吐詞含混，張口稍受限，口唇及舌尖有多處咬傷、潰瘍；眼周、口周、頸部、四肢可見不自主運動；頸部肌張力增高，雙上肢肌力減退，四肢腱反射減弱，四肢共濟運動欠穩準。輔助檢查CK、CK-MB、LDH、ALT及AST均升高。神經傳導檢查回示感覺性周圍神經損害，顱腦MRI可見尾狀核頭輕度萎縮。先證者哥哥(Ⅱ1)，35歲去世，生前癥狀與先證者一致；先證者父親(Ⅰ1)，先證者母親(Ⅰ2)，近親結婚，體健；先證者姐姐(Ⅱ2)，體健。見圖1、圖2。

先證者 正常人注：箭頭所指為尾狀核頭。圖1 先證者與正常人的顱腦MRI圖像對比Fig.1 Comparison of MRI images between the proband's and normal human's brain

圖2 先證者家系圖Fig.2 Family map of the proband

2.2先證者外周血紅細胞的掃描電鏡

先證者外周血掃描電鏡結果可見典型棘紅細胞(正常人外周血無棘紅細胞)。見圖3。

注：A為放大倍數6 000×，B為放大倍數10 000×；箭頭所示為典型棘紅細胞。圖3 先證者外周血紅細胞掃描電鏡結果Fig.3 Scanning electron micrograph of peripheral blood red blood cells in the proband

2.3致病基因篩查

通過高通量全外顯子測序和突變位點生物信息學分析結果表明，先證者檢測出VPS13A基因且存在c.9403C>T純合突變(基因型為TT純合子)，引起chorein蛋白p.R3135X突變，為無義突變；SIFT數據庫預測結果為“damaging”，PolyPhen-2數據庫預測結果為“probably damaging”。先證者的父親和母親均為c.9403C>T雜合突變。見圖4。

圖4 先證者及其父母VPS13A基因核苷酸c.9403C>T突變位點測序結果Fig.4 Sequencing of nucleotide mutations c.9403C>T in the VPS13A gene of proband and his parents

3 討論

神經—棘紅細胞增多癥 (neuroacanthocytosis，NA) 是一類罕見的神經遺傳性疾病，具有低患病率和高臨床變異性的特點[9]。NA可分為ChAc、MLS、HDL2和PKAN4種亞型[14-15]，其中以ChAc最多見[16]。ChAc常見于20～30歲人群，臨床表現包括[14,17-18]：(1)運動過多型運動障礙，如肢體舞蹈樣動作，口腔、面、舌不自主運動，進食性肌張力障礙、扮鬼臉、怪異表情等為該病最常見癥狀；(2)口唇自噬動作，表現為不自主唇舌咬傷，伴口腔潰瘍，該癥狀對該病具有特異性診斷價值[5]；(3)磨牙征，表現為不自主牙齒咀嚼行為；(4)帕金森病樣表現，如運動遲緩、靜止性震顫、肌張力增高等；(5)癲癇發作，其中以強直—陣攣發作多見；(6)認知障礙，以注意力和執行功能為主；(7)神經精神癥狀，表現為淡漠、抑郁及焦慮等；(8)周圍神經損害癥狀，表現為麻木、無力、肌萎縮、腱反射減弱或消失。ChAc在影像學檢查上可見尾狀核(尤其是尾狀核頭)和豆狀核萎縮、低代謝、低灌注，相應可見側腦室前腳擴大[17]；臨床生化檢查中可見肌酶、轉氨酶增高，其中肌酸激酶增高更具有特異性[14]。本例患者主要表現為口面部不自主動作、口唇自噬及四肢舞蹈樣動作，且相關輔助檢查均符合該疾病的特異表現，故根據臨床資料高度考慮ChAc。此外，有研究認為，此類患者外周血涂片或者掃描電鏡檢測到典型棘紅細胞，且典型棘紅細胞增多大于3%對于ChAc具有重要診斷價值[1,5]。本例患者外周血掃描電鏡檢測到了典型棘紅細胞，比例約25%，故進一步支持ChAc的診斷。但外周血棘紅細胞在MLS中同樣也較為常見[1,12]，故不易鑒別。

根據以上臨床資料及掃描電鏡結果，目前基本可以明確為ChAc，但ChAc與NA其他3種亞型在臨床特征、實驗室檢查及影像學表現上存在交叉性，鑒別診斷存在較大困難[7]。故本研究進一步行基因檢測。本例先證者檢測到VPS13A基因的c.9403C>T點純合突變(基因型為TT純合子)，可導致chorein蛋白的p.R3135X突變，且系低頻變異；SIFT數據庫預測結果為"damaging"，PolyPhen-2數據庫預測結果為"probably damaging"，按照ACMG發布的最新基因變異解讀標準和指南，考慮為可能致病(likely pathogenic)。同時，結合先證者家系資料，其兄生前具有與先證者一致的臨床表現，均表現頭面部及肢體的舞蹈樣動作。而先證者父母均為雜合突變(基因型為CT雜合子)，并且臨床表現無舞蹈癥狀。因此，說明VPS13A(c.9403C>T)點突變在本研究ChAc遺傳家系中符合常染色體隱性遺傳方式。已有研究表明ChAc以常染色體隱性遺傳為主，定位于9q21的VPS13A基因是目前公認已知的致病基因，翻譯產物是chorein蛋白[19]。紅細胞是由膜脂質、膜蛋白及血影蛋白—肌動蛋白骨架協同維持[20]，而chorein蛋白參與了肌動蛋白的聚合反應，其功能障礙可能導致細胞膜破裂和異常的紅細胞形狀[19]。故VPS13A基因突變導致chorein蛋白的改變對該疾病有重要的診斷價值[12]。VPS13A基因突變形式多樣，不同VPS13A基因突變可引起chorein蛋白功能性缺如或合成減少，最終導致ChAc的發生與發展[5,21]。目前，VPS13A基因測序和chorein蛋白定量檢測被認為是ChAc的確診性診斷標準[5]。因此，本文結果與已經報道的ChAc遺傳家系VPS13A基因遺傳方式相符合[5,16]。在鑒別診斷方面，MLS是一種罕見的X連鎖疾病，由XK基因突變引起[22]；HDL2是一種常染色體顯性遺傳性疾病，由位于6q24-3染色體的JPH3基因內的CTG/CAG三核苷酸重復擴增引起[23-24]；PKAN是一種染色體20p13上編碼泛酸激酶2的PANK2基因突變引起的常染色體隱性遺傳疾病[25-26]。因此，通過基因檢測不僅可以準確診斷ChAc，并且在鑒別診斷方面亦有重要的意義。

綜上所述，雖然結合臨床表現及掃描電鏡檢查可以高度懷疑ChAc，但全外顯子目標序列捕獲2代測序技術可準確檢測VPS13A基因突變，并結合遺傳家系特點，可作為ChAc首選確診手段。