大鼠骨髓源內皮祖細胞的分離與鑒定*

Nganguem Nzalle Yranney Brice，林慕之，毛善永，張蓓，周海燕，胡柏龍，王藝明，況春燕，劉興德,6***

(1.貴州醫科大學附院 心血管內科，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院 心血管內科,貴州 貴陽 550002；3.貴州醫科大學附院 超聲科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫科大學附院 麻醉科，貴州 貴陽 550004；5.貴州醫科大學附院 心理科，貴州 貴陽 550004；6.貴州中醫藥大學第二附屬醫院 心血管內科，貴州 貴陽 550025)

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPC)是內皮細胞的前體細胞，雖然其在外周血液循環中所占比例較小，但能促進缺血性組織的血管修復和新生[1]。前期研究表明，骨髓源內皮祖細胞(EPCs)在缺血性疾病的治療中起到關鍵作用，例如在急性心肌梗死[2-3]、不穩定心絞痛[4-5]、中風[6]、糖尿病微血管病[7]、肺動脈高壓[8]及動脈粥樣硬化[3，9]等疾病中。因此，研究EPC的生長、遷移及其他生物學特性，可為缺血性疾病的治療提供實驗基礎。文獻從骨髓[10-11]、心臟血[12]、或胎鼠肺[13-14]中均可提取EPCs，本課題組建立從SD大鼠骨髓中獲取單個核細胞，分離、培養并鑒定EPCs的方法，該方法穩定、經濟且有效避免細胞污染，為今后探索EPCs的生物學特性奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

SD大鼠購自貴州醫科大學，雄性，約8周齡，體質量(150±20) g。DMEM低糖培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自四季青公司，CD34-PE抗體購自Abcam公司，CD133-DyLight 488抗體購自Novus公司，VEGFR2-FITC抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1EPCs的分離 SD大鼠麻醉后用頸椎脫臼法處死，將大鼠固定于操作臺上，酒精常規消毒3次；取下并分離大鼠雙側股骨及脛骨，用含10%胎牛血清的PBS沖洗3遍；兩端剪除少許骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器抽取大鼠臟器組織淋巴細胞分離液試劑盒中的勻漿沖洗液沖洗大鼠股骨及脛骨骨髓腔，獲得含骨髓細胞的沖洗液置于50 mL離心管中，將沖洗液用200目的細胞篩網過濾，得到細胞懸液；3 000 r/min，離心10 min，棄上清，用樣本稀釋液重懸細胞，并將細胞濃度調整為2×105～1×106個/L，取15 mL離心管，加入6 mL大鼠臟器組織淋巴細胞分離液，并將獲得的骨髓細胞懸液緩慢加入離心管中；2 000 r/min，離心30 min，離心完畢可以觀察到3層細胞，底層為紅細胞和粒細胞層，中層為白膜層、此層為單個核細胞層，最頂層為血漿層。用吸管輕輕吸取中層細胞。

1.2.2EPCs的培養 將分離細胞以3×102個/L密度接種于細胞培養板中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行貼壁培養，48 h后更換20%新鮮完全培養基(DMEM低糖培養基含20%胎牛血清，青霉素105U/L，鏈霉素100 mg/L)，去除未貼壁的細胞，每5 d換液1次。

1.2.3EPCs的鑒定及檢測 收集培養7 d的EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化，置于流式上樣管中，將消化所得細胞用PBS 1 000 r/min離心5 min清洗3次，棄上清；用PBS 100 μL重懸細胞，每管加入LCD34-PE 2 μL和CD133-DyLight 488抗體2 μL，另取一管加入VEGFR2-FITC 2 μL，4 ℃避光孵育30 min、用PBS洗滌離心、使用PBS 400 μL重懸細胞，避光保存待上機檢測。

1.3觀察指標

1.3.1EPCs細胞觀察 倒置顯微鏡下觀察大鼠骨髓來源EPCs細胞培養在48 h、1周及2周時的形態學變化，采用流式細胞儀鑒定EPCs細胞表面標志物CD34、CD133及VEGFR2的表達。

1.3.2生長曲線的測定 分別消化并收集培養2、4、5、7、8、10、14及18 d的EPCs，在血球計數板上計數，每次取3個孔細胞，計算平均值，根據計數結果，繪制生長曲線。

1.4統計學分析

2 結果

2.1EPCs細胞形態

EPCs細胞培養48 h時，大部分懸浮的細胞已經貼壁生長，可見細胞呈多邊形、梭形、多角形；培養1周細胞逐漸變大、細胞數增多，呈鋪路石樣；培養2周的大部分細胞可見明顯增多，可見克隆樣集落。見圖1。

培養48 h 培養1周 培養2周圖1 大鼠骨髓來源EPCs形態學觀察(40×)Fig.1 The morphology of EPCs isolated from rat bone marrow(40×)

2.2流式細胞儀鑒定EPCs

EPCs培養7 d時，采用流式細胞儀檢測共表達CD34-PE和CD133-DyLight 488細胞比例(圖2A)。結果顯示，CD34+和CD133+雙陽性細胞占總體(22.15±1.002)%、CD34+單陽性細胞占(21.32±1.044)%及CD133+單陽性細胞占(28.67±0.711)%；VEGFR2+細胞數量(17.91±1.418)%，較未經染色對照組(1.52±0.129)%顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖2B、C、D)。結果提示，該細胞為EPCs。

注：(1)與Unstain組比較，P<0.05。圖2 流式細胞儀鑒定EPCs細胞中CD34、CD133及VEGFR2的表達Fig.2 The expression levels of CD34,CD133 and VEGFR2 on EPCs by flow cytometry

2.3EPCs的生長曲線

血球計數板計數后，制作細胞生長曲線，結果提示，細胞生長的潛伏期在第1～4天；第5～9天時，EPCs增殖迅速，進入指數增生期；第10～13天時，細胞生長進入平臺期；第14天以后，細胞逐漸進入衰亡期。見圖3。

圖3 EPCs細胞生長曲線Fig.3 The growth curve of EPCs

3 討論

自1997年Asahara等[15]首先發現骨髓來源的EPCs細胞后，EPC在心血管健康中的重要作用日益被人們所認識。成熟內皮細胞的再生能力有限，因此，研究者對循環的內皮祖細胞日益重視，特別是對其可維持內皮完整性、功能及產后新生血管的作用[16]。研究表明，EPCs不僅可恢復損傷后的內皮功能，而且還可參與血管生成，為新的治療帶來希望[17-18]。越來越多的證據表明，在心血管疾病的情況下，EPCs功能會下降和受損[19-20]。因此，目前在臨床中應用EPCs對缺血性心臟病進行治療成為研究熱點。隨著研究深入，各課題組分別從骨髓、心臟及胎鼠肺等提取EPCs。研究證實，骨髓中EPCs是外周血的15倍[21]，因此，從骨髓中提取EPCs是一種高效的方法。本課題組分離大鼠雙側股骨及脛骨，可獲得約4×107左右細胞，可以滿足后續實驗需求。此外，在本實驗中發現約8周齡SD大鼠適合提取EPCs，周齡過大或者過小對于骨髓來源的EPCs的數量提取都會產生較大影響。

現有一系列不同的方法鑒定EPCs，傳統上EPCs被定義為表達內皮細胞標志物(VEGFR2)和標記祖細胞標志物(CD34/CD133)的細胞，然而圍繞這個定義有相當多的爭論，因為這些標記都不是完全特異性的[22-23]。相關研究報道，CD34+、CD133+及VEGFR2+細胞是造血性細胞，實際上可能不是真正的EPCs[24]。隨著研究深入，目前研究表明，EPCs細胞表面的標志物并不是固定的，而是一個動態演變的過程，隨著內皮祖細胞向內皮細胞演變的過程中，其干性逐漸丟失[25]，干細胞的標志物CD133也逐漸降低直至丟失，但確定為內皮祖細胞至少能表達干細胞特征CD133、CD34或者內皮細胞的特征VEGFR2[26-27]。Schemidtlucke等[28]研究也闡明將流式細胞儀鑒定CD34和VEGFR2雙陽性且CD45弱陽性的細胞定義為EPCs。根據本課題組研究表明，課題組選用CD34、CD133及VEGFR2表達陽性的鑒定內皮祖細胞，結果提示所培養的細胞確實為EPCs細胞。

綜上所述，本課題組建立了一系列從大鼠骨髓細胞中分離，培養及鑒定內皮祖細胞的方法，該方法便捷、高效、經濟，為進一步探索EPCs細胞的分化、增殖、遷移及其他生物學特性奠定了堅實的實驗基礎。