大鼠Slfn3基因重組腺病毒載體的構建和包裝*

Nganguem Nzalle Yranney Brice，毛善永，莫麗莉，林慕之，張蓓，周海燕，王藝明，況春燕，劉興德,5***

(1.貴州醫科大學附院 心血管內科，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院 心血管內科,貴州 貴陽 550002；3.貴州醫科大學附院 超聲科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫科大學附院 心理科，貴州 貴陽 550004；5.貴州中醫藥大學第二附屬醫院 心血管內科，貴州 貴陽 550025)

Schlafen(Slfn)基因家族是可以調控T淋巴細胞活化及胸腺成熟的一系列重要基因[1-2]。目前Slfn基因家族包括10種鼠源基因，成員蛋白都有一個“Slfn盒”，“Slfn盒”與其臨近的ATP/GTP可結合至AAA結構域上，根據蛋白質的長短，該家族蛋白可以分為3個不同亞類[3-4]。Slfn3屬于中等長度蛋白，其蛋白亞型有一個由5個氨基酸(Ser-Trp-Ala-Asp-Leu)組成的高度保守 “SWADL”序列[5]。研究表明Slfn家族蛋白可以作用于Cyclin D1抑制細胞的增殖、分化及衰老等[6-7]，但仍有部分功能尚不清楚。本課題組前期研究發現Slfn1可抑制內皮祖細胞的增殖和遷移[8]，但是對于Slfn3的生物行為學調控尚未闡明，為了探討Slfn3對內皮祖細胞的生物學影響，本研究擬構建攜帶Slfn3基因的重組腺病毒載體pAdeno-EF1-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，并在HEK293細胞中完成包裝及擴增，獲得重組腺病毒rAD-Slfn3，為其在內皮祖細胞中研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 高保真的PrimeSTAR酶、TaKaRaMiniBEST割膠回收試劑盒、pAdeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG載體、AxyPrep質粒DNA小量試劑盒、無縫克隆試劑盒、T4 DNA連接酶、DH5α感受態細胞及限制性內切酶NheI及測序引物均由華大基因公司提供或合成，并負責進行陽性克隆的測序。

1.1.2儀器 DNA電泳槽、穩壓電泳儀及凝膠成像儀購自Bio-rad公司，PCR儀購自Applied Biosystems公司，冷凍高速離心機購自Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的構建 以GeneBank中已經收錄的大鼠Slfn3基因(Genebank ID：XM_017597672.1)的cDNA為模板，用VectorNTI軟件進行引物設計并對該片段進行PCR，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，并把目的基因條帶從電泳后的瓊脂糖凝膠中切割下來，經過膠回收后將目的基因片段和線性化載體反應，連接產物轉化到DH5a；挑取陽性克隆提取質粒，經限制性內切酶NheI酶切鑒定，酶切鑒定正確序列送華大基金進行檢測，測序正確后命名為pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，示意圖見圖1A，測序引物序列為Slfn3-F CTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTT，Slfn3-R CCTCGACTGTGCCTTCTA。

1.2.2細胞培養與腺病毒包裝 HEK293細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。利用Admax系統，將穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG與腺病毒輔助質粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉染到HEK293細胞中獲得重組腺病毒rAD-Slfn3。

1.2.3病毒擴增 將HEK293細胞鋪在10 cm皿中，待細胞匯合達到90%以上，加入合適滴度病毒感染細胞，5～6 d后，細胞全部病變，收獲細胞將其反復凍融3次，收獲病毒并將其分裝。

1.2.4病毒滴度測定 取5.0×105個HEK293細胞接種于24孔板，常規培養，將稀釋的病毒液加入24孔板中，感染48 h后，傾去培養液，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計病毒感染細胞效率，顯微鏡下數熒光陽性的細胞集落，選擇5個視野，在10×的物鏡下觀察陽性細胞數，計算每孔平均陽性細胞數和病毒滴度。病毒滴度(PFU/mL)=(每個視野下陽性細胞個數×每個視野細胞的個數×稀釋倍數)/0.1 mL。

1.2.5Western blot分析 因穿梭質粒上帶有Flag標簽，rAD-Slfn3感染HEK293細胞48 h后，收集細胞并將其裂解，提取蛋白樣本，用Western blot鑒定HEK293細胞是否表達Flag蛋白。

2 結果

2.1穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的構建

將割膠回收得到的Slfn3通過線性化載體pAdeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG反應，挑取陽性克隆提取質粒，經限制性內切酶NheI酶切鑒定，發現Slfn3成功插入目標載體中(圖1B)。測序分析(圖1C)顯示pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG包含Genebank公布的Slfn3基因序列，表明pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG構建成功。

注：A為穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的示意圖，B為PCR電泳結果，C為測序結果。圖1 穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAGFig.1 The map,digestion pattern and Slfn3 sequencesofpAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG

2.2病毒包裝

選取測序正確的pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG和輔助質粒共轉染HEK293細胞，轉染11 d后可見細胞大量漂浮，在熒光顯微鏡下可見細胞呈綠色(見圖2)，收集細胞并獲得重組腺病毒rAD-Slfn3。

熒光顯微鏡 普通光鏡圖2 轉染后11 d鏡下HEK293細胞形態(40×)Fig.2 GFP expression in HEK293 cellsunder fluorescence microscope and optical microscope on 11th days after transfection(40×)

2.3轉染HEK293細胞Flag標簽的表達

檢測轉染穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293細胞與對照組細胞，結果顯示，轉染pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293細胞可以表達Flag標簽，目的基因Slfn3的預測蛋白大小約為67 kDa，其大小與預測一致，而對照組無Flag蛋白表達(見圖3)。

注：1為Marker，2為HEK293細胞，3為轉染空質粒的HEK293細胞，4為轉染穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293細胞。圖3 Flag標簽的檢測(Western blot)Fig.3 Flag expression in HEK293 cells transfected with or without pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG(Western blot)

3 討論

Slfn家族成員在細胞增殖、分化及其調節免疫應答等方面都有重要作用[9]。研究發現Slfn1、1L、2、3、4、5、8、9、10及14在鼠中表達[10-14]；Slfn5、Slfn11、Slfn12，Slfn13及Slfn14在人體內表達[15-18]。Slfn家族成員在T細胞激活，胸腺成熟等生物學過程中起重要作用。Slfn3最初在鼠睪丸中發現，其在心臟和胸腺中的表達量較低[19]。研究發現，在T細胞激活時，Slfn3的表達明顯增加[20-21]。同時，Slfn3也可在CD4+CD25+的循環T細胞中表達，這意味著Slfn3在調控T細胞分化等免疫應答過程中起重要作用[22]。此外，研究發現Slfn3可通過增加p27的表達，抑制CDK2的表達，從而調控細胞周期，抑制細胞增殖[20]。但是，Slfn3是否可以調控心血管系統，對內皮祖細胞增殖及其遷移的影響及機制迄今為止尚未研究。本研究構建穿梭質粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，并將該質粒與輔助質粒共轉染HEK293細胞，獲得重組腺病毒rAD-Slfn3，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達，并通過Western Blot鑒定其表達該質粒，為后續探索其對內皮祖細胞的增殖和遷移奠定了實驗基礎。

構建腺病毒的方法主要有Adeno-X系統、Adeasy系統及其AdMax系統[23]。Adeno-X系統是采用體外直接連接的方法，效率較低，因酶切位點有限，限制了該方法的應用[24-25]。Adeasy系統及其AdMax系統都是運用同源重組的研究原理，Adeasy系統是利用在細菌體內同源重組的原理[26-27]，AdMax系統利用了HEK293細胞內同源重組的原理，利用Cre/loxP重組酶將攜帶外源基因的穿梭質粒與骨架質粒在HEK293細胞中重組，產生腺病毒[28]，本研究利用AdMax系統獲得重組腺病毒rAD-Slfn3，該系統具有效率高、產率高及操作簡便等特點。通過上述實驗，本研究通過菌落PCR和測序證實該穿梭質粒序列正確后，將其與輔助質粒共轉染HEK293細胞中進行包裝后鑒定，重組腺病毒感染HEK293細胞后，檢測細胞中Flag標簽的表達情況，結果發現Flag標簽在病毒感染的細胞中表達，確定獲得重組腺病毒rAD-Slfn3。

綜上所述，本研究成功構建了大鼠Slfn3基因rAD-Slfn3重組腺病毒載體，為研究該基因對心血管系統的調控及其對內皮祖細胞增殖及其遷移的影響奠定了堅實的實驗基礎。