基于網(wǎng)絡藥理學的延胡索干預心力衰竭作用機制研究

陳晶　王萌　侯志濤

摘要：目的??采用網(wǎng)絡藥理學方法探究延胡索干預心力衰竭可能的作用機制。方法??檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中國天然產(chǎn)物化學成分庫，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、生物半衰期（HL）≥4.00對延胡索可能的生物活性成分進行篩選，并通過蛋白質數(shù)據(jù)庫Uniprot篩選出各活性成分可能存在的靶點，通過CTD、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫挖掘心力衰竭相關的作用靶點。通過基因注釋工具Metascape分析延胡索干預心力衰竭的分子機制。結果??篩選出延胡索生物活性成分26個，預測出延胡索與心力衰竭相關的靶點210個，蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建篩選出關鍵靶點37個。Metascape分析顯示，延胡索干預心力衰竭的關鍵靶點主要與炎癥反應、細胞凋亡和調節(jié)腸道菌群等生物過程有關。結論??延胡索不僅可直接對心力衰竭起到治療作用，還可通過抗炎、抑制細胞凋亡及調節(jié)腸道菌群間接發(fā)揮療效。

關鍵詞：延胡索;心力衰竭;網(wǎng)絡藥理學;信號通路;作用機制;腸道菌群

中圖分類號：R259.416.1;R285.5????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0071-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903319

Study?on?Mechanism?of?Intervention?of?Corydalis?Rhizoma?in?Heart?Failure?Based?on?Network?Pharmacology

CHEN?Jing，?WANG?Meng，?HOU?Zhitao

Heilongjiang?University?of?Chinese?Medicine，?Harbin?150040，?China

Abstract：?Objective?To?explore?the?possible?mechanism?of?intervention?of?Corydalis?Rhizoma?in?heart?failure?by?using?network?pharmacology.?Methods?TCMSP?and?chemical?separation?of?natural?products?in?China?were?used.?According?to?oral?bioavailability?（OB）?≥30%，?drug-likeness?（DL）?≥0.18，?biological?half-life?（HL）?≥4.00，?bioactive?components?of?Corydalis?Rhizoma?were?screened，?and?the?possible?targets?of?each?active?components?were?screened?out?through?the?protein?database?Uniprot.?Heart?failure-related?targets?were?explored?through?the?CTD，?TTD，?and?DrugBank?databases.?The?molecular?mechanism?of?intervention?of?Corydalis?Rhizoma?in?heart?failure?was?analyzed?by?the?gene?annotation?tool?Metascape.?Results?Totally?26?bioactive?components?of?Corydalis?Rhizoma?were?screened?out，?and?210?targets?of?interventing?heart?failure?were?predicted.?The?PPI?network?was?constructed?to?screen?37?key?targets.?Metascape?analysis?showed?that?the?key?targets?of?Corydalis?Rhizoma?intervention?in?heart?failure?were?mainly?related?to?inflammatory?response，?apoptosis?and?regulation?of?intestinal?flora?and?other?biological?processes.?Conclusion?Corydalis?Rhizoma?can?not?only?directly?treat?heart?failure，?but?also?indirectly?play?roles?through?anti-inflammation，?anti-apoptosis?and?regulation?of?intestinal?flora.

Keywords：?Corydalis?Rhizoma;?heart?failure;?network?pharmacology;?signaling?pathway;?mechanism;?intestinal?flora

心力衰竭是一種心臟功能代償失調綜合征，可由各種發(fā)展到終末期的心血管疾病引起，其發(fā)病機制復雜且發(fā)病率高，嚴重危害人類健康[1-2]。心力衰竭的臨床表現(xiàn)以乏力、呼吸困難和體液潴留為主[3]。目前

西醫(yī)治療以“金三角”（β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物、醛固酮受體拮抗劑）為指導方案，以神經(jīng)內分泌抑制劑為主，可在一定程度上改善癥狀，但效果有限[4]。近年來，中醫(yī)藥治療心力衰竭取得較好療效，其中口服藥物是主要治療途徑之一。中藥治療具有多方位、多靶點及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，可提高患者生活質量并有效控制疾病發(fā)展，具有較廣闊的發(fā)展前景。

延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis?yanhusuo?W.T.Wang的干燥塊莖，入心、胃、肝、肺、脾經(jīng)，其味辛、苦，性溫，具有活血散瘀、理氣止痛功效，主治胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛，經(jīng)閉痛經(jīng)等，是臨床治療心力衰竭常用組方藥物之一。現(xiàn)代藥理研究顯示，延胡索具有改善心臟功能的作用[5]，但其作用機制及物質基礎目前尚未完全明確，深入研究延胡索干預心力衰竭可能的分子機制對其臨床應用具有重要意義。

網(wǎng)絡藥理學通過數(shù)據(jù)庫檢索、分析，采用復雜網(wǎng)絡模型，從系統(tǒng)水平解釋藥物與機體相互作用的關系與機制，其復雜性符合中藥多靶點、多成分的特點，是中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的新方向。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法深入挖掘延胡索的主要活性成分及干預心力衰竭可能的作用靶點，闡述其作用機制。

1??資料與方法

1.1??藥物活性成分篩選

運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）與中國天然產(chǎn)物化學成分庫（http：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc/），搜索關鍵詞“延胡索”，獲得其活性成分信息。運用TCMSP，根據(jù)成分藥動學吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)進一步篩選，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、生物半衰期（HL）≥4.00[6]。

1.2??藥物作用靶點預測與疾病靶點查詢

將篩選出的延胡索生物活性成分對應的靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）UniprotKB檢索功能對各靶點人類基因簡稱進行查詢，獲得延胡索可能存在的靶蛋白。使用CTD（http：//ctdbase.org/?about/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫，以“heart?failure”為關鍵詞進行查詢，獲得心力衰竭疾病過程中已知的靶蛋白。

1.3??成分-靶點網(wǎng)絡構建

通過Venny圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/?venny/index.html）將延胡索活性成分靶點與心力衰竭疾病靶點取交集，得到延胡索與心力衰竭相關的靶點。使用Cytoscape3.7.1構建成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.4??蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建

將取交集后的靶點導入在線系統(tǒng)String11.0（http：//string-db.org/），獲得蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡。該系統(tǒng)對每個參與作用的蛋白進行打分，分值越高表明相互作用關系越密切。本研究設置分值>0.9，以保證數(shù)據(jù)的可靠性。

1.5??生物通路分析

使用基因注釋工具Metascape（http：//metascape.org）對PPI網(wǎng)絡中的關鍵靶點進行生物通路富集分析，分析延胡索干預心力衰竭主要參與的生物通路，探討延胡索干預心力衰竭可能的作用機制。

2??結果

2.1??延胡索活性成分及相應靶蛋白

初步檢索得到已知的延胡索活性成分77個，其中符合OB、DL和HL篩選條件的生物活性成分共26個，以生物堿居多，見表1。

表1??延胡索生物活性成分

2.2??藥物靶點預測

對26個生物活性成分進行靶點預測，共獲得592個靶蛋白，其中包含1個糞腸球菌（gyrb）。運用Metascape對592個靶蛋白的整理結果見圖1。其中外側圓環(huán)表示延胡索26個活性成分;內側圓環(huán)中的淺黃色表示該活性成分特有靶點，深黃色表示與其他成分共有的靶點;紫色線連接活性成分間共同靶點，藍色線提示成分與成分間存在的相互作用關系。刪除重復靶點后剩余靶點212個。

圖1??延胡索活性成分靶點環(huán)形圖

2.3??疾病靶點與成分-靶點網(wǎng)絡

查詢CTD、TTD、DrugBank共得到心力衰竭相關靶點31?397個。通過Venny圖取交集得到延胡索中參與心力衰竭的靶點210個。利用Cytoscape3.7.1繪制的延胡索干預心力衰竭成分-靶點網(wǎng)絡圖見圖2。該網(wǎng)絡圖包括236個節(jié)點，其中活性成分節(jié)點26個、靶蛋白節(jié)點210個。成分靶點間共存在590條相互作用關系。分析發(fā)現(xiàn)延胡索中最主要的前8種活性成分為：槲皮素（度=151），牡丹草堿（度=35），四氫小檗堿（度=31），豆甾醇（度=31），隱品堿（度=28），表木栓醇（度=28），延胡索堿（度=28），畢枯枯林（度=27）。

分析靶點節(jié)點信息可以發(fā)現(xiàn)，與5個以上活性成分存在關系的靶點有27個（見表2），分別為PTGS2、PTGS1、SCN5A、KCNH2、F10、CAM、CHRM3、ADRA1B、CHRM5、ADRB2、CHRM1、OPRD1、OPRM1、RXRA、PRKACA、ADRA1D、HSP90AB1、TOP2B、CHRM4、NCOA2、HTR2A、AR、NOS3、PRSS1、DRD1、HTR3A、F7。其中，PTGS2、PTGS1、SCN5A、KCNH2、F10、ADRB2、RXRA不僅度相對較高，介數(shù)中心性也較大，提示這些靶點在延胡索干預心力衰竭的機制中發(fā)揮重要作用。

注：紅色代表活性成分，綠色代表共有靶點，黃色代表特有靶點

圖2??延胡索干預心力衰竭活性成分-靶點網(wǎng)絡

表2??延胡索干預心力衰竭潛在靶點信息

2.4??蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建

延胡索干預心力衰竭的PPI網(wǎng)絡見圖3。使用Cytoscape3.7.1軟件進行整理分析，可更清楚地反映延胡索干預心力衰竭的作用機制。該網(wǎng)絡圖中包含163個表示靶蛋白的節(jié)點與716條表示相互作用關系的線。節(jié)點大小與度的大小呈正相關，節(jié)點越大表示度越大;線的粗細與關聯(lián)程度呈正相關，關聯(lián)越密切線越粗。進一步分析發(fā)現(xiàn)，度>均值（8.78）且介數(shù)中心性>均值（0.013）的關鍵靶蛋白有37個，靶蛋白MAPK1的度和介數(shù)中心性均最大，表明MAPK1在整個網(wǎng)絡中作用較大。

2.5??生物通路富集分析

將延胡索干預心力衰竭的PPI網(wǎng)絡篩選出的37個重要靶點進行富集分析，獲得重要靶點參與的生物過程及通路（見圖4、圖5）。圖4、圖5B中，富集程度用顏色深淺表示，顏色越深表明富集程度越好。圖5A中不同顏色節(jié)點表示不同通路。可以看出，延胡索干預心力衰竭的關鍵靶點主要參與癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、細胞凋亡。此外還有已知的常見通路，如MAPK、TGF-β等信號通路，進一步說明延胡索干預心力衰竭存在復雜的機制和過程。

3??討論

心力衰竭屬中醫(yī)學“心水”“心悸”“心痹”等范疇，其中醫(yī)證型分類尚無統(tǒng)一標準，目前被廣泛認可的證型大致包括心陽虛脫、肺腎兩虛、氣虛血瘀、陽虛水泛等，其中以氣虛血瘀證的認可度最高[8]。氣帥血行，氣虛則不能推動血液正常運行，血行不暢，瘀血阻滯于心脈，心不能正常發(fā)揮其生理功能。心為五臟六腑之大主，故瘀阻心脈可出現(xiàn)各臟腑經(jīng)絡病變，臨床表現(xiàn)為咳嗽、胸悶氣短、四肢水腫、脈結代等。此外，心力衰竭與多種心血管疾病關系密切，且可由多種心血管疾病加重所致，如心肌缺血、冠心病、心律不齊等。目前對心力衰竭的治療以活血補氣藥為主。

臨床應用活血補氣類中藥治療心力衰竭具有較好療效。張伯禮主張用益氣活血法治療心力衰竭，方用八珍湯加減配伍延胡索、郁金、桑枝、葛根等，八珍湯補益氣血以養(yǎng)心，配以延胡索、郁金理氣活血、化瘀止痛，桑枝祛瘀通絡，葛根調暢氣機，該法可使患者左室射血分數(shù)明顯上升[9]。馬曉昌主張以生脈飲為基礎方配伍延胡索等治療心力衰竭氣陰兩傷證，患者胸悶喘憋、心悸、氣陰兩虛癥狀明顯好轉[10]。翁維良以龍膽瀉肝湯加延胡索等治療肝火上炎型胸痹，其中龍膽瀉肝湯可瀉肝膽實火，延胡索可發(fā)揮活血行氣化瘀之功，治療后患者心絞痛發(fā)作次數(shù)明顯減少，睡眠質量提高，大便恢復正常，精神狀態(tài)好轉[11]。可見，在治療心力衰竭的多種復方中均包含延胡索，說明延胡索臨床用于治療心力衰竭具有較為重要的意義。

延胡索主要化學成分為生物堿、甾體、有機酸、糖類[12]。現(xiàn)代藥理研究表明，延胡索可有效治療疼痛、高血壓，還能擴張冠狀動脈，增加血液流通，保護大鼠心功能，緩解大鼠心力衰竭[5，13]。本研究通過TCMSP初步篩選得到延胡索生物活性成分77個，根據(jù)ADME參數(shù)進一步篩選，得到26個活性成分，挖掘出212個可能存在的靶點，與已知的31?397個心力衰竭相關靶點取交集，最終獲得延胡索干預心力衰竭的210個靶點，590個可能存在的關系。本研究表明，延胡索的關鍵作用靶點包括MAPK1、PTGS2、PTGS1、SCN5A、KCNH2等，重要靶點與多個化學成分存在關系。其中SCN5A已被證實與心律不齊及心肌病有密切聯(lián)系，可影響治療心律不齊藥物的敏感程度[14]。有研究表明，SCN5A突變可增加心力衰竭的患病率[15]。KCNH2的表達可影響心室肌細胞Kr和Ks重構，從而導致心力衰竭[16]。PTGS2作為前列腺素合成的關鍵酶，對炎癥反應與細胞凋亡起抑制作用，從而與心力衰竭發(fā)生關聯(lián)[17]。值得注意的是，我們在對延胡索活性成分對應的靶點分析過程中發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌gyrb是延胡索的有效作用靶點之一，而糞腸球菌gyrb是人體腸道內最重要的菌群之一，可產(chǎn)生有利于機體健康的抗生素，并可調節(jié)腸道微環(huán)境[18]。通過對腸道內菌群的改善實現(xiàn)對心力衰竭的治療，可能是延胡索發(fā)揮抗心力衰竭作用的又一有效機制，目前尚未發(fā)現(xiàn)相關文獻報道，因此開展延胡索或含延胡索的復方制劑通過腸道菌群調控心力衰竭的研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義，有望為心力衰竭的治療提供新的途徑。

延胡索各活性成分間存在著密切的協(xié)同關系，其主要的靶點也在心力衰竭中發(fā)揮著至關重要的作用。為進一步對延胡索干預心力衰竭的作用機制進行分析，將二者關系進行PPI網(wǎng)絡構建與生物通路富集分析，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路是網(wǎng)絡中的關鍵靶點主要富集的信號通路。PI3K是胞內磷脂酞肌醇激酶的一種，可參與多種生命活動發(fā)揮關鍵作用。Akt作為PI3K下游的信號分子，可參與下游底物的活化。研究表明，PI3K-Akt信號通路主要與細胞生長和凋亡密切相關，可通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)在心力衰竭中抑制心肌細胞凋亡，通過對心臟收縮和舒張功能的改善而發(fā)揮治療作用[19]。PI3K-Akt信號通路可通過減少mPTP釋放，在線粒體水平上發(fā)揮心肌保護作用，從而達到治療心力衰竭的目的[20]。此外，PI3K-Akt信號通路可令其內源性因子GSK3β磷酸化失活，從而使心肌重構[20]。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）作為細胞表面分子的免疫球蛋白RAGE的重要配體，可誘導巨噬細胞釋放白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子-α參與免疫炎性反應。炎癥因子在心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，可抑制心肌收縮并控制心輸出量，炎癥因子含量是判斷心力衰竭嚴重程度的指標。此外，AGEs在人體內的含量也會影響心衰，AGEs含量增多可加重心肌僵硬程度[21]。缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）作為生物體內最典型的低氧反應信號通路，在體內缺氧情況下及時啟動一系列生物反應，提高氧分水平。HIF-1α對心肌細胞起到重要的保護作用，HIF-1α含量增加可促進心肌細胞存活和血管生成[22-23]。HIF-1α可誘導PPARγ基因啟動子表達參與心肌能量代謝。作為重要的促炎癥因子的IL-17，由激活的CD4+T淋巴細胞表達，其表達水平與心肌損害程度呈正相關。研究表明，IL-17廣泛參與心力衰竭的發(fā)展過程，可能與IL-17參與體內炎性反應與免疫應激反應有關[24]。

本研究表明，延胡索干預心力衰竭的機制存在復雜性與多樣性，通過復雜網(wǎng)絡中可提煉出多種治療方案。故在治療心力衰竭時應“因人制宜”，確定適合的通路與主要相關靶點，針對性的治療可顯著提高療效，符合中醫(yī)辨證論治的指導思想。中醫(yī)藥治療具有多方面、多靶點的優(yōu)勢，不僅在主要通路與靶點上發(fā)揮作用，還可與其他次要靶點協(xié)同發(fā)揮療效，是方劑“君、臣、佐、使”配伍原則的另一種表現(xiàn)形式。但臨床治療心力衰竭多用復方，本研究僅針對延胡索單味中藥展開研究存在一定的局限性，后續(xù)將側重藥對及復方的配伍機制研究，進一步揭示中藥治療疾病多成分、多靶點、作用方式多樣的機制特點。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學研究方法，對延胡索干預心力衰竭復雜機制進行研究，發(fā)現(xiàn)延胡索發(fā)揮作用的主要生物活性成分包括黃連素、黃連堿、隱品堿等生物堿類。各成分不僅可對心力衰竭起到直接治療作用，還可通過抗炎、抑制細胞凋亡以及調節(jié)腸道內菌群間接起效。總之，本研究建立的延胡索成分-靶點-通路復雜網(wǎng)絡可為延胡索干預心力衰竭作用機制提供理論基礎，為進一步實驗研究提供方向。

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（收稿日期：2019-03-25）

（修回日期：2019-04-18;編輯：陳靜）