翡翠貽貝酶解液體外降壓活性評價方法研究

安婷婷 王鶴 鄧長春 林資政

摘要?[目的]研究翡翠貽貝酶解液的體外降壓活性，為后期開發藥品和保健食品等提供前期的理論和試驗基礎。[方法]采用反向高效液相色譜法檢測翡翠貽貝酶解液的體外降壓活性。色譜柱：YMC?C18柱（250?mm×4.6?mm，5?μm）;流動相：A為0.1%TFA乙腈，B為0.1%TFA水;測定波長228?nm;流速1?mL/min;進樣量20?μL。[結果]該方法使翡翠貽貝降血壓肽、HHL和馬尿酸較好地分離，在0.02～0.20?mg/mL線性關系良好（R2=?0.997?2），最低檢出限為50?ng，定量限為200?ng，平均回收率為101.87%。[結論]該方法簡便、快速、靈敏度高，可用于評價翡翠貽貝降血壓肽的體外活性。

關鍵詞?翡翠貽貝酶解液;反相高效液相色譜法;體外;降壓活性

中圖分類號?TQ914.2文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0219-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.062

Study?on?the?Method?for?Evaluating?the?Antihypertensive?Activity?of?the?Enzymatic?Hydrolysate?of?Perna?viridis?in?vitro

AN?Tingting，WANG?He，DENG?Changchun?et?al

（Pharmaceutical?Institute?of?Hainan?Province，Haikou，Hainan?570311）

Abstract?[Objective]?The?research?aimed?to?study?the?antihypertensive?activity?of?the?emerald?mussel?enzymatic?hydrolysate?in?vitro，?and?to?provide?the?theoretical?and?experimental?basis?for?the?early?development?of?drugs?and?health?foods.[Method]The?RPHPLC?method?was?established?for?determining?the?activity?of?enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis?in?vitro.It?was?analyzed?by?HPLC?on?a?YMC?C18?colunm（250?mm×4.6?mm，5?μm）?and?detected?at?the?wavelength?of?228?nm;mobile?phase：?A?was?0.1%?TFA?acetonitrile，?B?was?0.1%?TFA?water;the?velocity?of?flow?was?1.0?mL/min?and?sample?size?was?20?μL.[Result]This?method?could?separate?the?enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis，HHL?and?hippuric?acid?well.?There?was?perfect?linear?correlation?between?0.02-0.20?mg/mL（R2=?0.997?2）.?The?detection?limit?was?50?ng?and?the?limit?of?quantitation?was?200?ng.The?average?recovery?rate?was?101.87%.[Conclusion]The?method?is?simple，?rapid?and?sensitive.?It?can?be?used?to?evaluate?the?enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis?activity?in?vitro.

Key?words?Enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis;RPHPLC?method;in?vitro;Antihypertensive?activity

基金項目?海南自然科學基金面上項目（817201）。

作者簡介?安婷婷（1982—），女，河北新樂人，高級工程師，碩士，從事新藥研發、質量標準建立、海洋藥物方面研究。

收稿日期?2019-10-12

高血壓是一種危險的多發病，同時它又是動脈硬化、冠心病、心臟及腎臟功能衰竭的最主要的致病因素，全球患高血壓人數已超過5?億。目前，普遍采用治療高血壓的藥物都是化學合成藥物，長期服用會產生各種副作用，故醫務人員與患者更青睞于非化學合成藥物療法[1-2]。降血壓肽又稱為血管緊張素轉化酶抑制肽（angiotensin?converting?enzyme?inhibitory?peptides，簡稱ACEIPs），其通過抑制血管緊張素轉換酶（ACE）的活性，阻礙血管緊張素Ⅱ的生成以及抑制血管舒緩激肽的分解而達到降血壓的作用[3]。Je等[4]從發酵貽貝中分離到顯著活性的降血壓肽。

翡翠貽貝（Perna?viridis（Linnaeus）），又名綠殼菜蛤、淡菜或青口螺，廣泛分布于東海南部和南海，容易人工養殖，繁殖能力很強，產量高。翡翠貽貝肉風味獨特，牛磺酸的含量豐富[5]，富含DHA、EPA[6]、糖胺聚糖[7-9]，具有特殊的類似于蠔的香味，中醫認為翡翠貽貝性溫，能補五臟、理腰腳、益陽事、調經活血，是重要的經濟貝類之一。翡翠貽貝酶解液為翡翠貽貝經過一系列酶解產生的、含有大量的降血壓肽，該研究主要開發一套適合翡翠貽貝酶解液的體外活性評價方法，為后期開發藥品和保健食品等提供前期的理論和試驗基礎，也為開發海南的經濟貝類作出貢獻。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?研究對象。翡翠貽貝酶解液，海南省藥物研究所自制。

1.1.2

主要儀器。高效液相色譜儀（島津，HPLC-2010AHT）;循環水式多用真空泵（SHZ-95）;超聲微波清洗儀（SK450HP）;臺式高速冷凍離心機（TGL-16MC）。

1.1.3

主要試劑。馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL，SIGMA，美國）;血管緊張素轉化酶（ACE，上海源葉生物科技有限公司）;馬尿酸（140738-200501，中檢所）;乙腈（HPLC級）;三氟乙酸（TFA，HPLC級）;純化水為海南省藥物研究所自制;其他試劑均為國產分析純。

1.2?方法

1.2.1?對照品溶液的制備。精密稱取馬尿酸標準品40?mg，用超純水稀釋，定容至100?mL容量瓶中，配制成0.4?mg/mL馬尿酸標準液。

1.2.2

供試品溶液的制備。80?μL?5?mmol/L?HHL與30?μL翡翠貽貝酶解液均勻混合，加入30?μL的0.1?mol/L硼酸鹽緩沖液（pH?8.3，含0.3?mol/L?NaC1），混勻，加入10?μL?0.1?U/mL?ACE溶液，37?℃下水浴反應35?min，反應完成后加入150?μL?1?mol/L?HCl溶液中止反應，離心，為供試品溶液。

1.2.3

色譜分析條件。色譜柱：YMC?C18（250?mm×4.6?mm，5?μm）;流動相：A為0.1%TFA乙腈，B為0.1%TFA水，流動相時間程序如表1所示;檢測波長228?nm[10-11];流速1.0?mL/min;進樣量20?μL。

1.2.4?方法學考察。

1.2.4.1

系統適應性試驗。分別吸取對照品溶液、供試品溶液、5?mmol/L?HHL溶液、空白（硼酸鹽緩沖液）各20?μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統適應性。

1.2.4.2?線性關系的考察。將馬尿酸對照品溶液用純水稀釋制成每1?mL含0.02、0.04、0.06、0.08、1.00、1.20?mg的系列溶液，分別吸取20?μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進樣濃度X（mg/mL）為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.3

檢測限和定量限的考察。將馬尿酸對照品溶液逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時的進樣量為最低檢測限（LOD），S/N為10時的進樣量為最低定量限（LOQ）。

1.2.4.4?穩定性試驗。取同一供試樣品溶液，按“1.2.3”色譜分析條件分別于0、0.5、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0?h進樣，進樣量20?μL，測定峰面積積分值，計算RSD。

1.2.4.5?精密度試驗。取按“1.2.1”方法制備的馬尿酸對照品溶液重復進樣6次，計算峰面積的RSD值。

1.2.4.6

加樣回收試驗。取同一批次的翡翠貽貝酶解液分為9份，每3份分別加入10、20、30?μL?0.4?mg/mL馬尿酸標準溶液，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測定，進樣量為20?μL，測定峰面積，計算平均回收率和RSD。

2?結果與分析

2.1?系統適應性試驗?圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，馬尿酸的保留時間為15.990?min，HHL出峰保留時間為27.064?min，且在供試品溶液中分離度均大于1.5。由此可見，此色譜條件下能夠分離供試品中的各個物質。

2.2?線性關系的考察

按“1.2.4.2”方法操作，峰面積分別為1?256?896、2?594?000、4?327?563、5?740?945、6?901?320、13?246?812，以進樣濃度X（mg/mL）為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線如圖2所示，計算得線性回歸方程為Y=7E+07X+151?856（R2=0.997?2），表明馬尿酸在0.02～0.20?mg/mL呈良好的線性關系。

2.3?檢測限和定量限的考察?按“1.2.4.3”方法操作，結果表明，馬尿酸的檢測限和定量限分別為50和200?ng。

2.4?穩定性試驗?按“1.2.4.4”方法操作，峰面積分別為2?275?842、2?236?815、2?269?853、2?206?398、2?296?442、2?230?150、2?215?963，計算得出平均峰面積為2?247?352，峰面積積分值的RSD為1.5%，表明馬尿酸在24?h內比較穩定。

2.5?精密度試驗?按“1.2.4.5”方法操作，峰面積分別為2?251?855、2?278?469、2?261?029、2?241?584、2?271?489、2?230?369，計算得出平均峰面積為2?255?799，峰面積的RSD為0.81%，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.6?加樣回收試驗?由表2可見，馬尿酸的平均回收率為98.9%，RSD為0.73%，表明該方法準確、可靠，可用于供試品中馬尿酸的含量測定。

3?結論與討論

該試驗建立了一種評價翡翠貽貝酶解液體外活性評價的高效液相色譜方法，此方法在馬尿酸為0.02～0.20?mg/mL具有良好的線性關系，平均回收率為98.9%，在24?h內穩定性良好。可見HPLC法方便、準確、快速，可以作為篩選高降壓活性的翡翠貽貝酶解液的快速分析方法。此外，在試驗過程中，筆者發現已溶解的ACE酶在-20?℃的條件下極易失活，且價格昂貴，建議實驗室自制。筆者研究了加入1?moL/L?HCl鹽酸終止反應后，加入1.2?mL乙酸乙酯提取后過濾進樣，發現回收率僅為50%，故乙酸乙酯提取并不適用于翡翠貽貝酶解液的降壓活性評價。

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