解鉀菌ZMD02的解鉀活性及生長特性研究

吳俊林 郭傳濱 賈真 郝浩浩 許曉敬 楊立均 孫會忠

摘要?采用火焰分光光度法對從煙草根際土壤中分離到細菌ZMD02的解鉀活性進行了測定，結果表明，在28?℃、180?r/min條件下發酵培養7?d后，菌株ZMD02發酵液中水溶性速效鉀含量達1.5?μg/mL，故將ZMD02定性為硅酸鹽菌株。對ZMD02的生長特性研究表明，ZMD02對不同糖源的發酵產氣能力表現為葡萄糖>麥芽糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉;對碳同化能力表現為麥芽糖>葡萄糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉;ZMD02對不同氮源的同化能力表現為酵母膏>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>尿素;ZMD02的最適生長溫度為30?℃，最適pH為7。ZMD02菌株可作為煙草生物鉀肥開發的備用菌株。

關鍵詞?煙草;解鉀菌;生長特性

中圖分類號?S572文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0170-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.048

Potassium?Dissolving?Activity?and?Growth?Characteristics?of?Silicate?Bacteria?ZMD02

WU?Junlin，GUO?Chuanbin，JIA?Zhen?et?al

（Zhumadian?Branch?of?Henan?Provincial?Tobacco?Company，Zhumadian，?Henan?463000）

Abstract?The?potassium?activity?of?bacteria?ZMD02?isolated?from?tobacco?rhizosphere?soil?was?determined?by?flame?spectrophotometry.?The?results?showed?that?after?7?days?of?fermentation?at?28?℃?and?180?r/min，?the?content?of?watersoluble?rapidly?available?potassium?in?ZMD02?fermentation?broth?reached?1.5?μg/mL.?Therefore，?ZMD02?was?characterized?as?silicate?strain.?The?growth?characteristics?of?ZMD02?showed?that?the?order?of?fermentation?capacity?of?ZMD02?to?different?sugar?sources?was?glucose?>?maltose?>?lactose?>?amylose?>?amylose.?The?order?of?carbon?assimilation?ability?was?maltose?>?glucose?>?lactose?>?amylose?>?amylose.?The?order?of?assimilation?ability?of?ZMD02?to?different?nitrogen?sources?was?yeast?extract?>?peptone?>?ammonium?sulfate?>?nitrate?>?urea.?The?optimum?growth?temperature?of?ZMD02?was?30?℃?and?the?optimum?pH?was?7.?ZMD02?strain?could?be?used?as?an?alternative?strain?for?the?development?of?biopotash?fertilizer?in?tobacco.

Key?words?Tobacco;Silicate?bacteria;Growth?characteristics

基金項目?河南省煙草公司駐馬店市公司項目“植煙土壤的微生物定向調控保育技術研究”;河南省高等學校重點科研項目（16A180003）。

作者簡介?吳俊林（1986—），男，河南駐馬店人，助理農藝師，從事煙葉生產與管理研究。

收稿日期?2019-10-02

鉀不是生物細胞的結構成分，但鉀素具有維持細胞結構、保持細胞的滲透壓、吸收養分和構成酶的輔酶等生理功能，由于鉀易被植物秸稈、果實、籽粒等形式帶走，土壤作為一個天然鉀庫，90%～98%的鉀存在于硅酸鹽礦物質中，植物并不能直接吸收利用[1-3]。因此，必須不斷補充鉀才能滿足植物生長發育的需要，尤其對于嗜鉀作物煙草而言，補充鉀素顯得尤為重要[4-6]。解鉀菌（silicate?bacterium）是一類可以分解硅酸鹽礦物的細菌，也稱為硅酸鹽細菌，它能夠使礦物中的鉀分解為植物科吸收利用的有效鉀[7-9]。隨著煙草有機（綠色）生產發展理念的提倡和推廣，生物鉀肥在煙草產量提高和品質改善方面的作用越來越受到重視，在此大背景下，分離篩選野生解鉀菌菌種資源具有極強的理論價值和應用潛力。筆者從煙草根際土壤分離到一株細菌，編號為ZMD02，對其解鉀活性及其生長特性進行研究，以期為該菌株的誘變育種、生物鉀肥開發等下游研究奠定理論基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

解鉀菌ZMD02：分離于煙草的根際土壤，保存于駐馬店市煙草公司生產技術中心實驗室。

解鉀菌發酵培養基：按100?g培養基計，分別含有鉀長石0.30?g（超純水水洗5次），磷酸氫二鈉0.20?g，碳酸鈣0.01?g，七水硫酸鎂0.5?mg，三氯化鐵0.5?mg，蔗糖0.50?g，海藻糖0.10?g，瓊脂粉1.80?g，pH控制在7.0～7.5。

基礎培養基：蔗糖6.00?g，硫酸鎂0.30?g，硫酸銨0.20?g，氯化鈉5.00?g，瓊脂粉18.00?g，蒸餾水1?L，pH?7.0。

斜面培養基：采用LB培養基[10]。

1.2?方法

1.2.1?菌株產鉀能力測定。

目標菌株在LB培養基中活化培養后，取OD600=0.2的菌液按2%接種量接種于發酵培養基，設置不接種的空白對照，在28?℃、160?r/min條件下培養7?d。每24?h取樣一次，于4?℃、1?000?r/min離心10?min，采用火焰分光光度計測定離心后上清液中水溶性速效鉀含量[2，11]。3次重復取平均值，下同。

1.2.2?菌株生長特性測定。

糖發酵能力：在基礎培養基中分別選取葡萄糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、麥芽糖和乳糖作為糖源配制培養基，按2%接種量（OD600?=?2，下同）接入待測菌株，在28?℃培養48?h，觀察杜氏管內氣體高度。

碳同化能力：在基礎培養基中分別選取葡萄糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、麥芽糖和乳糖作為碳源配制培養基，按2%接種量接入待測菌株，培養28?℃培養72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

氮同化能力：在基礎培養基中分別選取硫酸銨、硝酸鉀、尿素、酵母膏和蛋白胨作為氮源，按2%接種量接入目標菌株，28?℃培養72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

生長溫度：在基礎培養基中分別按2%接種量接入待測菌株，分別置于16、20、24、28、32、36、40?℃條件下培養72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

生長pH：分別將基礎培養基的pH調整為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%接種量接入待測菌株，28?℃培養72?h，用分光光度計測定菌體OD600。

2?結果與分析

2.1?菌株ZMD02的解鉀能力

經過7?d連續發酵，菌株ZMD02發酵上清液中，速效鉀含量存在變化，發酵液中的速效鉀含量從第3天開始迅速增加，第6天達到最大值1.5?μg/mL，而對照的速效鉀含量未見增加，說明未接種ZMD02的對照中不存在從鉀長石中分解釋放出的游離態有效鉀（圖1）。故ZMD02具有解鉀活性，定性為解鉀菌。

2.2?菌株ZMD02的生長特性

由圖2可知，菌株ZMD02對5種糖源的發酵產氣能力存在明顯差異，由大到小依次為葡萄糖>麥芽糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉。考察ZMD02對碳同化的能力時，也顯示出不同，由大到小為麥芽糖>葡萄糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉，說明麥芽糖是菌株生長的最佳碳源（圖3）。ZMD02對5種氮源的同化能力表現為酵母膏>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>尿素（圖4）。ZMD02的最適生長溫度為28?℃，低于20?℃和高于36?℃時，菌株長勢明顯減弱（圖5）。中性酸堿度環境是ZMD02的最適生長pH（圖6）。

3?討論

該研究從煙草根際土壤中分離獲得菌株ZMD02，菌株經7?d發酵后發酵上清液中速效鉀含量達1.5?μg/mL，解鉀活性較強，無論作為誘變育種的出發菌株或直接作為生物鉀肥原始菌株，均具有較高的研究價值和開發潛力。土壤是微生物的大本營，根際環境因為植物根系活動與微生物的代謝經過長期的協同進化，從根際環境分離出的土著菌株，在應用開發上具有天然的生態適應性優勢[12-13]，因此，ZMD02對煙草生產具有重要意義。雖然土壤中微生物種類繁多，但不同生境的微生物多樣性特征存在差異，很多時候即使是同一種微生物，來源不同，微生物個體的生物學特征也表現出特定的差異[12，14]，因此大量分離功能菌株，仍是一項非常具有價值的基礎性工作。

土著菌株初始酶活性的高低常常不能作為判斷該菌株是否具有價值的唯一依據，且土著野生菌株直接應用往往出現田間施用效果不穩定的情況，故后期通過紫外線、化學誘變劑等提高土著出發菌株的功能效果，幾乎是菌株深度開發的必要環節[15-17]，因此，對ZMD02的后續工作將著重加強這方面的研究。該研究對ZMD02菌株生長特性的初步探索，明確了菌株不同碳源、氮源、生長溫度和酸堿度的響應特征，也為后期的理論和應用研究提供了有益參考。

參考文獻

[1]?林先貴.土壤微生物研究原理與方法[M].北京：高等教育出版社，2010：326.

[2]?劉光燁，林洋，黃昭賢.硅酸鹽細菌解鉀兼拮抗活性菌株的篩選[J].應用與環境生物學報，2001，7（1）：66-68.

[3]?馬娜，李嵩，孫濤，等.鉀細菌對土壤養分轉化強度及馬鈴薯品質的影響[J].中國馬鈴薯，2016，30（4）：218-225.

[4]?龔文秀，曹媛媛，倪海婷，等.煙草親和性解鉀PGPR菌株篩選及其促生效果研究[J].中國煙草學報，2016，22（1）：55-63.

[5]?樊文強，孫鑫，楊愛國，等.基于關聯分析發掘煙草高鉀優異等位變異[J].中國煙草學報，2016，22（2）：100-107.

[6]?劉璇，孔凡玉，張成省，等.煙草根際解鉀菌的篩選與鑒定[J].中國煙草科學，2012，33（3）：28-31.

[7]?吳向華，劉五星.土壤微生物生態工程[M].北京：化學工業出版社，2012：94-96.

[8]?袁振宏.能源微生物學[M].北京：化學工業出版社，2012：2-5.

[9]?張愛民，張雙鳳，趙鋼勇，等.膠凍樣類芽孢桿菌CX-9菌株肥料制劑的研制及在煙草上的應用[J].河北大學學報（自然科學版），2013，33（4）：387-393.

[10]?楊汝德.現代工業微生物學實驗技術[M].北京：科學出版社，2009：254.

[11]?王珣玨，黃曉云，蔡鵬，等.解鉀菌解鉀效率檢測方法的比較[J].華中農業大學學報，2016，35（1）：81-85.

[12]?徐麗華，婁愷，張華，等.微生物資源學[M].2版.北京：科學出版社，2010：138-140，206-216.

[13]??燕紅，代英杰，彭顯龍.微生物資源及利用[M].哈爾濱：哈爾濱工程大學出版社，2012：258-264.

[14]?王國惠.環境工程微生物學——原理與應用[M].北京：化學工業出版社，2015：164-166.

[15]?施巧琴，吳松剛.工業微生物育種學[M].北京：科學出版社，2009：95-98.

[16]?黃小云，林娟，林小洪，等.產木聚糖酶海洋微生物的篩選與誘變育種[J].福州大學學報（自然科學版），2015，43（5）：715-721.

[17]?刁治民，周富強，高曉杰，等?農業微生物生態學[M].成都：西南交通大學出版社，2008：231-234.