基于SSR標記的油桃品種需冷性分析

史芳芳 梁武軍 張延磊

摘要?[目的]利用已發表的桃SSR引物分析桃品種資源圃油桃遺傳多樣性，以期為油桃育種和反季節栽培研究提供參考。[方法]利用24對SSR引物分別對27個油桃品種進行PCR擴增，篩選出多態性好、穩定性高的引物對27個油桃品種進行毛細管電泳分析，并采用遺傳相似系數對擴增結果進行分析。[結果]從合成的24對SSR引物中篩選出5對條帶清晰、具有多態性的引物，利用聚類分析軟件，將油桃分成兩大類，第一大類包括23個栽培種，其遺傳系數在0.9以上，第二大類包括4個原始種，其遺傳系數在0.75～0.85，同時鑒別出2個同物異名的栽培種質資源。[結論]基于文獻中發表的SSR桃引物篩選出多態性較好的引物可用于油桃SSR分析。毛細管電泳可以將擴增條帶分離至1?bp，能更好地區分種內差異。27個油桃品種有2個原始品種，即臺農甜蜜和黑油皇后，與23個栽培品種親緣關系較遠，可以作為母本進行雜交育種，且可以作為需冷性品種候選種質。

關鍵詞?油桃;SSR;親緣關系;種質資源

中圖分類號?S662.1文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0059-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.019

SSR?Analysis?on?Required?Cooling?of?Nectarin?Cultivated?Varieties

SHI?Fangfang，?LIANG?Wujun，ZHANG?Yanlei

（Institute?of?Agricultural?Sciences?of?the?12th?Division?of?Xinjiang?Production?and?Construction?Corps，?Urumqi，Xinjiang??830088）

Abstract?[Objective]?To?provide?reference?for?nectarine?breeding?and?offseason?cultivation，the?genetic?diversity?of?nectarine?in?peach?variety?resource?nursery?was?analyzed?by?using?published?peach?SSR?primers.?[Method]?27?nectarine?varieties?were?amplified?by?PCR?with?24?pairs?of?SSR?primers.?27?nectarine?varieties?were?analyzed?by?capillary?electrophoresis?with?the?good?polymorphism?and?high?stability?primers，?and?the?amplification?results?were?analyzed?by?genetic?similarity?coefficient.[Result]?Five?pairs?of?primers?with?clear?bands?and?polymorphism?were?selected?from?24?pairs?of?SSR?primers.Nectarine?was?divided?into?two?categories，?the?first?of?which?included?23?cultivated?species，in?which?the?genetic?coefficient?of?cultivated?species?was?above?0.9.The?second?group?consisted?of?4?original?species，that?of?original?species?was?between?075?and?0.85，meanwhile?it?could?clearly?identify?the?synonyms?of?two?germplasm?resources.[Conclusion]?Based?on?the?SSR?peach?primers?published?in?the?literature，?the?primers?with?good?polymorphism?could?be?used?for?SSR?analysis?of?nectarine.?Capillary?electrophoresis?could?isolate?the?amplified?bands?to?1bp.?There?were?two?original?species?of?27?nectarine?varieties，?namely?Tainong?sweet?and?black?oil?queen，?which?were?not?closely?related?to?23?cultivated?varieties?and?could?be?used?as?female?parents?to?cross?breeding，and?can?be?used?as?a?candidate?germplasm?for?required?cooling?research.

Key?words?Nectarine;SSR;Genetic?relationship;Germplasm?resources

基金項目?十二師農業科技攻關項目“果樹種質資源引種與省力高效標準化栽培示范”（SR2016024）;十二師農業科技攻關項目“盆栽桃規?；a關鍵技術研究與示范”（SR2017015）。

作者簡介?史芳芳（1977—），女，山東濰坊人，高級農藝師，碩士，從事農作物育種及農業科研推廣工作。通信作者，高級農藝師，從事農業科研推廣工作。

收稿日期?2019-09-04

目前，很多基層科研單位在開展桃品種的引種篩選試驗研究，一方面進行品種適應性觀察試驗，另一方面為今后開展桃品種雜交試驗提供較為豐富的種質，但多數單位僅從果實性狀調查、植株長勢等農藝性狀方面進行判斷，或從形態學方面對品種進行分類，因此對于一些種間的雜種進行歸類十分困難[1]，致使調查、評價篩選不足[2]。隨著研究水平的深入，對種質資源的遺傳評價已上升到分子水平[3]，調查本區域內資源圃中油桃的親緣關系對種質資源的遺傳評價及今后開展育種工作具有重要意義。桃種質資源收集、利用、評價是桃育種創新的基礎[4]。桃的種質資源分析多集中在對本地區內的桃品種進行遺傳評價[5-6]，而對具有豐富地域性的引進品種進行遺傳分析的較少。筆者利用已公布的SSR分子標記，對收集保存于新疆第十二師農科所果樹資源圃，來源于全國南北方各地品種或品系27份油桃種質，包括栽培品種（系）、原始種質進行遺傳分析，從DNA水平評估遺傳多樣性，并進一步探究引進的原始種質與栽培品種間的親緣關系，為今后的遺傳育種提供可靠的遺傳背景信息。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

油桃種質資源共27份，均來自于新疆兵團第十二師農業科學研究所桃資源圃，包括原始種和栽培種。供試材料信息見表1。

1.2?SSR擴增

利用上海生工工程有限公司植物提取試劑盒進行DNA提取，從已發表的SSR引物[7-10]中篩選出能在27份樣本間穩定擴增、多態性好的5對薔薇類SSR引物（表2）用于遺傳分析。反應體系20?μL，擴增程序：94?℃預變性3?min，94?℃預變性30?s，55?℃退火30?s，72?℃延伸30?s，30次循環;72?℃延伸10?min;4?℃保存。擴增結束后，加入微量上樣緩沖液混勻，5?μL擴增產物瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，150?V穩壓電泳20?min。電泳結束后凝膠成像系統紫外成像觀察擴增效果和多態性。將擴增產物寄到杭州奧盛儀器有限公司進行毛細管電泳SSR分析。

1.3?統計分析

選取擴增清晰的條帶，在相同遷移位置，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，不同引物擴增的結果構成原始的“0，1”二元數據矩陣。將矩陣用NTSYSPC軟件進行數據分析，相似性數據采用Dice系數，選用UPGMA法進行聚類分析。

2?結果與分析

2.1?SSR擴增結果及多態性引物篩選

將供試的27份油桃品種或品系用不同的SSR引物進行擴增，經過毛細管電泳后以條帶多態性為標準，從合成的24對SSR引物中篩選出5對條帶清晰、具有多態性的引物（表2）。這些引物共擴增出

54條DNA片段，具有多態性片段15條，占比28%，平均每個引物11.2條，最多15條，最少7條，擴增片段的長度多數集中在100～300?bp，圖1為引物CPPCT002擴增的情況，小于100?bp條帶不計作有效帶，因此，此引物有效擴增條帶為5條，即141、127、135、156、163?bp。

2.2?遺傳多樣性及系統進化分析?依據聚類分析。27份油桃種質可劃分為2個類群（圖2），23個品種（系）歸為第一大類，屬于栽培種，遺傳距離在0.9以上，其中，鄭4-24與旭日遺傳距離為0，相似系數為1，可能是品種的地區交叉傳播產生的同物異名現象。其余4個品種（系）歸為第二大類，屬于原始品種，在遺傳距離為0.87處，金海霞與短枝油桃聚在一起，0.77處臺農甜蜜單獨一類，0.75處黑油皇后也單獨一類?？傮w聚類表明，栽培品種間存在較低的遺傳變異，遺傳背景相近。原始品種遺傳變異較栽培種高，遺傳背景與栽培種較遠，其中，地方品種黑油皇后與其他栽培種品種遺傳距離最遠。

從相似性矩陣（圖3）可以看出，黑油皇后與其他品種相似系數在0.59～0.81，臺農甜蜜相似系數在0.59～083，短枝油桃相似系數在0.66～0.87，金海霞相似系數在0.72～090。結合聚類分析結果，黑油皇后可作為資源圃中與其他栽培種油桃雜交的最佳母本。

3?討論

3.1?SSR技術中應用毛細管電泳的優勢

SSR技術已被廣泛用于物種親緣關系分析，但目前，很多科研單位和大學為了節約成本或者大規模進行SSR篩選試驗仍在使用瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺電泳，二者的分辨率很低，特別是瓊脂糖凝膠電泳只能進行初篩，而且聚丙烯酰胺電泳試劑配制過程復雜，電泳時間長，需要染色、脫色等步驟，即便跑出條帶，有時會因為某個環節出現問題，導致最終電泳條帶顯示不明顯，或者沒有拉開條帶距離，不能將差異大小小于10?bp的基因片段分離開，條帶特異性表現不充分。

毛細管電泳原理基于微流體技術，分辨率可以達到?1?bp。與傳統毛細管電泳相比，毛細管電泳所需樣品量低于1?μL，檢測靈敏度能夠達到?5?pg/μL，樣品分析時間可短至幾十秒，而且分離檢測過程全部由儀器自動來完成，無人工介入，無交叉污染。與傳統電泳相比，毛細管電泳可用的引物范圍較廣，適用于絕大多數SSR引物，因此試驗成本更經濟。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，毛細管電泳根據峰值獲得的數值化數據更精確，后期數據分析更簡便，操作過程簡單，且通量高，全程無毒無害[11]。

該研究選用桃資源圃27份油桃資源作為試驗材料，采用?SSR?分析技術結合毛細管電泳檢測技術，篩選出適用于鑒定該試驗的油桃SSR引物5對，建立了一套簡單、經濟、高效的油桃品種（品系）親緣關系鑒定方法，為完善桃品種快速鑒定方法提供參考。

3.2?需冷量不同油桃篩選

新疆冬季時間比較漫長，種植的桃樹一般開花期和結果期均較內地晚，桃樹需冷量較高，但目前已有科研單位研究通過引進需冷量低的設施品種進行反季節栽培，達到提早上市。基于此，通過油桃SSR分析，結合物候期觀察試圖將低需冷量油桃品種（品系）與較高需冷量油桃品種（品系）分離開，便于篩選出適合于設施反季節栽培品種，并為今后開展桃品種雜交育種試驗提供參考。該研究將已知需冷量低的品種臺農甜蜜作為目標篩選品種，通過SSR分子標記分析，篩選出與臺農甜蜜遺傳系數接近的品種（品系）作為需冷量低的候選品種（品系），后期對初篩品種重點開展物候期觀察，最終確定反季節栽培品種。該研究結果表明黑油皇后、短枝油桃和金海霞品種與臺農甜蜜遺傳系數更為接近，可以作為今后研究重點。

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