腎上腺嗜鉻細胞瘤VEGF和iNOS表達與臨床特征的關系及相關性分析

高欣彤，史春玲，張 苗，龍兆博

嗜鉻細胞瘤為起源于腎上腺髓質、交感神經節或其他部位嗜鉻細胞的神經內分泌腫瘤，約80%～90%來自腎上腺，多為良性腫瘤[1]。本病臨床較為少見，但由于其病理特征、圍術期處理及預后等較其他腫瘤更為特殊，且從臨床表現、實驗室及影像學檢查等方面難以區分良惡性，往往易延誤患者治療。近年大量研究表明，血管內皮生長因子(VEGF)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)與腎上腺嗜鉻細胞瘤的發病有關[2-5]。為此，本研究選取我院存檔的腎上腺嗜鉻細胞瘤標本46例及正常腎上腺標本21例，探討腎上腺嗜鉻細胞瘤VEGF、iNOS表達與臨床特征的關系及相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎上腺嗜鉻細胞瘤標本：取自2010—2018年本院行手術治療后存檔的腎上腺嗜鉻細胞瘤石蠟標本46例，均經病理檢查確診，具有完整的臨床、隨訪資料。46例中男25例，女21例；年齡14～71(43.50±7.95)歲；單側29例，雙側17例；良性28例，惡性18例。正常腎上腺標本：取自同時期意外死亡者尸檢標本21例，男13例，女8例；年齡19～75(45.50±6.41)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑：兔抗人VEGF抗體購自北京中山生物技術公司，一氧化氮合酶2一抗購自Santa Cruz公司，二抗和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2.2 方法：組織切片常規脫蠟，沖洗后加3%過氧化氫處理以阻斷內源性過氧化物酶活性，采用免疫組織化學染色兩步法進行染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。分別以已知腎上腺嗜鉻細胞瘤VEGF和iNOS陽性結果作為陽性參考，以PBS液代替一抗、二抗結果作為陰性參考。

1.3 判別標準 以高倍顯微鏡下細胞質或細胞膜出現棕黃色或棕褐色顆粒沉著視為VEGF和iNOS陽性。每張切片隨機選取10個視野，觀察陽性細胞質表達強度并計算每個視野的陽性細胞數。無陽性細胞表示為“-”(陰性)，陽性細胞占比<15%、細胞著色呈淺棕色為“+”(弱陽性)，陽性細胞占比15%～60%、細胞著色呈棕黃色為“++”(陽性)，陽性細胞占比>60%、細胞著色呈棕褐色為“+++”(強陽性)。陽性表達率=(弱陽性+陽性+強陽性)例數/總例數×100%。

1.4 統計學方法 應用SPSS 18.0軟件處理數據。計數資料以率(%)描述，比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 正常腎上腺組織、良性及惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織VEGF和iNOS表達情況比較 VEGF、iNOS陽性表達率惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織>良性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織>正常腎上腺組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 正常腎上腺組織、良性及惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中VEGF和iNOS表達情況比較[例(%)]

注：VEGF為血管內皮生長因子，iNOS為誘導型一氧化氮合酶；A、B、C分別為正常腎上腺組織、良性及惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織；與A比較，bP<0.01；與B比較，dP<0.01

2.2 VEGF表達與腎上腺嗜鉻細胞瘤臨床特征的關系 腎上腺嗜鉻細胞瘤組織VEGF陽性表達率在性別、年齡、腫瘤側別、術前血壓方面無明顯差異(P>0.05)；直徑≥5 cm的腎上腺嗜鉻細胞瘤組織VEGF陽性表達率明顯高于直徑<5 cm的瘤組織陽性表達率，惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織VEGF陽性表達率明顯高于良性瘤組織陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 血管內皮生長因子表達與腎上腺嗜鉻細胞瘤臨床特征的關系[例(%)]

2.3 iNOS表達與腎上腺嗜鉻細胞瘤臨床特征的關系 腎上腺嗜鉻細胞瘤組織iNOS陽性表達率在性別、年齡、腫瘤側別、術前血壓方面無明顯差異(P>0.05)；直徑≥5 cm的腎上腺嗜鉻細胞瘤組織iNOS陽性表達率明顯高于直徑<5 cm的瘤組織陽性表達率，惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織iNOS陽性表達率明顯高于良性瘤組織陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 誘導型一氧化氮合酶表達與腎上腺嗜鉻細胞瘤臨床特征的關系[例(%)]

2.4 VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中表達的相關性分析 腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中VEGF和iNOS的表達呈正相關(r=0.452，P<0.001)。見表4。

表4 VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中表達的相關性

注：VEGF為血管內皮生長因子，iNOS為誘導型一氧化氮合酶

3 討論

腎上腺嗜鉻細胞瘤屬泌尿生殖系統腫瘤[6]，起源于腎上腺髓質，因其可釋放大量兒茶酚胺，臨床多表現為持續性或陣發性高血壓、腎上腺皮質激素分泌增加等代謝紊亂癥狀[7-10]。因腎上腺組織學結構獨特、生理功能特殊，若其發生病變，激素分泌紊亂，則難以維持機體正常的生理代謝[11-13]。但目前腎上腺嗜鉻細胞瘤的發病機制、生物學行為等尚未明確，早期難以通過現有的臨床檢測手段明確其良惡性，發現為惡性時往往已進展到晚期。腫瘤復發或出現轉移病灶可作為惡性嗜鉻細胞瘤的確診標準[14]。而腫瘤生長和轉移的必要條件為新生血管生成，VEGF是目前發現的最強的血管通透性因子，在血管生成中發揮著重要的作用[15-16]。

VEGF可增加微血管的通透性，刺激血管內皮細胞增殖、移行，誘導新血管生成，對于腫瘤的生長、浸潤和轉移具有促進作用。大量研究表明，VEGF在多種惡性腫瘤尤其是出現浸潤和轉移的惡性腫瘤中表達率為80%以上[17-19]。一氧化氮(NO)是一種腫瘤啟動劑，可損傷DNA、產生遺傳毒性，導致腫瘤發生[20-21]。NO對腫瘤具有雙重性，高濃度可引起細胞凋亡、抑制腫瘤生長，但適當濃度則有利于腫瘤生長。一般認為iNOS表達與腫瘤的生物學行為相關，iNOS活性上調后可引起NO合成增加至合適濃度，從而促進腫瘤生長。既往研究表明，在多種腫瘤中均存在VEGF和iNOS的高表達，二者呈正相關，在腫瘤發生發展、侵襲及轉移的每個階段均有聯合作用[22-24]。VEGF介導溶解基質、新血管網構建和管腔形成等腫瘤血管形成過程與NO的關系密不可分，其可通過多種途徑調節NO的釋放。

本研究表明，VEGF和iNOS在正常腎上腺組織、良性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織、惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中的陽性表達率分別為9.52%、46.43%、88.89%和4.76%、39.29%、83.33%，惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織VEGF和iNOS陽性表達率明顯高于良性瘤組織和正常腎上腺組織中的陽性表達率，且VEGF和iNOS在直徑≥5 cm、惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中的陽性表達率明顯高于直徑<5 cm、良性瘤組織中的陽性表達率；相關性分析顯示VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中的表達呈正相關。由此可見，可通過檢測VEGF和iNOS的表達來鑒別腎上腺嗜鉻細胞瘤的良惡性，VEGF和iNOS共同促成了腎上腺嗜鉻細胞瘤的發生、進展。

綜上所述，VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細胞瘤組織中的表達明顯高于正常腎上腺組織，二者的表達與性別、年齡、腫瘤側別、術前血壓無關，而與腫瘤直徑、良惡性相關，其在直徑≥5 cm、惡性瘤組織中的陽性表達率明顯高于在直徑<5 cm、良性瘤組織中的陽性表達率，且二者表達呈正相關，共同影響腎上腺嗜鉻細胞瘤的發生發展。