HPLC 法同時測定9 種中草藥中18 種多環芳烴殘留量

王宏偉，方 波，張 磊，楊 澤，王曼曼，王 茜

（華北理工大學公共衛生學院，河北 唐山 063210）

中草藥具有療效獨特、資源豐富等特點，已成為醫療實踐中不可或缺的一部分［1］，但隨著國際檢測標準的日益嚴格，外在有害殘留已成為其發展和國際貿易的絆腳石［2］，主要有霉菌毒素［3］、農藥［4］、重金屬［5］、多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等，其中多環芳烴是在自然環境普遍存在的持久性有機污染物，有16 種早已被美國環保署列為優先控制污染物，而歐盟的優先控制污染物清單更增至18 種［6］。中草藥不僅在種植生長過程中吸收土壤、水和大氣環境中的多環芳烴，同時在加工過程中炒、烘、焙、烤等高溫條件下也會產生，最終經過生物富集作用對人體健康產生巨大危害，其不同部位（包括花、葉、皮、莖、根、果實和種子）均會受到污染，總污染水平為21.1～2 856.0 ng／g［7］。因此，監測中草藥中多環芳烴的殘留量，對于規范其種植和生產過程、降低人體健康風險具有重要意義。

目前，相關檢測方法主要有HPLC［8-10］、GCMS／MS［11-13］、LC-MS／MS［14-15］等，其中HPLC 具有操作簡便、快速、靈敏度高、成本低、實驗條件易于實現［16］等優勢。提取和凈化是分析中草藥中多環芳烴最具挑戰性的環節，提取的前處理包括液液萃?。?］、固相萃取［13］、濁點萃?。?］等，其中固相萃取目標化合物的準確性和精密度較高，但價格昂貴，不易普及；濁點萃取操作簡單，應用范圍廣，萃取效率高，但對有機溶劑具有選擇性，需通過改變實驗參數來引發相分離；液液萃取雖費時費力，但相對于固相萃取法和濁點萃取法成本低，選擇性和提取效果良好，配以超聲波輔助萃取時能大大提高萃取效率，縮短提取時間，而且操作方法簡單，更易于推廣。因此，本研究選取9 種中草藥，包括花（野菊花、玫瑰花）、葉（銀杏葉、荷葉）、皮（陳皮、杜仲）、根（地黃、川牛膝）、莖（甘草），利用超聲波輔助液液萃取-固相萃取富集凈化多環芳烴，建立HPLC-FLD 法檢測其中18 種多環芳烴的殘留量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀，配置紫外熒光檢測器（美國Agilent 公司）；KDC-1044 低速離心機（科大創新股份有限公司）；ET-3301A氮吹濃縮儀（上海歐陸科儀有限公司）；超純水系統（美國Aquapro 公司）；ProElut Silica 硅膠柱（北京迪馬歐泰科技發展公司）。

1.2 試劑與藥物甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；丙酮（分析純，北京化工廠）；二氯甲烷、正己烷（色譜純，美國Sigam-Aldric 公司）。18 種多環芳烴對照品（10 μg／mL）包括萘（Nap）、苊烯（Acy）、苊（Ace）、芴（Fln）、菲（Phe）、蒽（Ant）、熒蒽（Flu）、芘（Pyr）、苯并［a］蒽（BaA）、屈（Chr）、苯并 ［b］熒蒽（BbF）、苯并［k］熒蒽（BkF）、苯并［J］熒蒽（BjK）、苯并 ［a］芘（BaP）、苯并 ［e］芘（BeP）、茚并［1，2，3-cd］芘（InP）、苯并［g，h，i］苝（BghiP）、二苯并［a，h］蒽（DBA），均購自美國迪馬公司。

野菊花、玫瑰花、銀杏葉、荷葉、陳皮、杜仲、地黃、甘草均購自唐山市某藥店。

1.3 樣品前處理 9 種中草藥經粉碎機粉碎，過60 目金屬篩后準確稱取1 g，置于50 mL 比色管中，加入10 mL 二氯甲烷／正己烷（1∶1）浸泡過夜。次日，將浸泡過夜的中草藥于25 ℃下超聲30 min，上清液倒入50 mL 燒杯中，再加入10 mL二氯甲烷／正己烷（1∶1）超聲30 min，合并萃取液于燒杯中，反復操作3 次。將合并液倒入離心管中，2 500 r／min 離心10 min，取上清液于氮吹管中濃縮至約2 mL，將濃縮液倒入固相萃取硅膠凈化柱中進行凈化，16 mL 二氯甲烷洗脫，再將洗脫液氮吹至近干后加入甲醇定容至1 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾待測。前處理過程見圖1。

圖1 各樣品前處理流程Fig.1 Preprocessing flow for various samples

1.4 色譜條件 Eclipse PAH 柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，80% A；15～30 min，85%～90%A；30～40 min，90%A）；柱溫30 ℃；體積流量0～30 min 1 mL／min，30～40 min 1.2 mL／min；進樣量10 μL。

18 種多環芳烴紫外檢測波長為254 nm；熒光檢測激發波長、發射波長分別為0～20 min 280、340 nm時，檢出物質按出峰時間排序依次為Nap、Acy、Ace、Fln、Phe、Ant、Flu、Pyr、BaA、Chr；分別為20～50 min 300、430 nm 時，檢出物質依次為 BbF、BkF、BjK、BaP、BeP、InP、BghiP、DBA。色譜圖見圖2。

圖2 多環芳烴標準樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of polycyclic aromatic hydrocarbon standard samples

2 結果與討論

2.1 前處理條件優化

2.1.1 萃取溶劑 中草藥基質復雜，化學成分多樣，通常從中提取多環芳烴的溶劑有正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈或其混合物。由于18 種多環芳烴極性低，結構差異大，本實驗考察了二氯甲烷、二氯甲烷-正己烷（1∶1）、丙酮-正己烷（1∶1）的萃取效果，見圖3，可知二氯甲烷-正己烷（1∶1）萃取效率較高，故以其為最佳萃取溶劑。

圖3 萃取液、萃取液體積、洗脫液對18 種多環芳烴回收率的影響（n＝3）Fig.3 Effects of extractionsolvent，extractionvolume and eluting solvent on the recoveries of eighteen PAHs（n＝3）

2.1.2 萃取溶劑體積 本實驗考察了二氯甲烷-正己烷（1∶1）體積為30、40、50 mL 時對萃取效果的影響，見圖3，可知當體積為40 mL 時目標分析物的回收率較高，故以其為最佳萃取溶劑體積。

2.1.3 超聲時間 為了提高萃取效率和縮短萃取時間，本實驗選用超聲波輔助提取。在相同條件下，考察了超聲時間10、20、30、60 min 時目標分析物的回收率，見圖4，可知30 min 時最高，故以其為最佳超聲時間。

圖4 超聲時間對18 種多環芳烴回收率的影響Fig.4 Effects of ultrasound time on the recoveries ofeighteen PAHs

2.1.4 凈化洗脫液 由于中草藥中雜質較多，在后續檢測時會產生大量干擾峰，影響對目標物的準確定量，因此凈化是前處理過程中至關重要的一步。本實驗選用對極性雜質具有較強親和力的硅膠柱凈化，凈化前用6 mL 正己烷活化，其間考察了二氯甲烷、二氯甲烷-正己烷（1∶1）、正己烷對洗脫效果的影響，見圖3，可知二氯甲烷最佳，故以16 mL 該溶劑為最佳凈化洗脫液。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系考察 在最優條件下，將18 種多環芳烴貯備液用甲醇配成一系列質量濃度的對照品溶液，在“1.4”項條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，分別以3 倍信噪比（S／N＝3）和10 倍信噪比（S／N＝10）計算檢出限和定量限，結果見表1。

2.2.2 加樣回收率、精密度試驗 取1 g 中草藥于比色管中，分別添加2 000、5 000 ng 對照品溶液，每個水平平行3 份，按“1.3”項下方法進行前處理，計算回收率。其中，除了Nap、Acy 外，其余16 種多環芳烴的回收率都超過80%，Nap、Acy 的低回收率可能是其低分子量和低沸點的特性，導致在蒸發過程中易損失。平均回收率及日內、日間RSD 分別為52.02%～103.1%、0.1%～5.6%、0.2%～14.2%。

表1 各多環芳烴線性關系Tab.1 Linear relationships of various PAHs

2.3 樣品測定 結果見表2，可知9 種中草藥中多環芳烴都被不同程度地檢出，其中荷葉、川牛膝、甘草中全部被檢測出來，陳皮中總量最高。目前，我國尚未對中藥材中多環芳烴殖留量作出規定，依據食品安全標準GB2762-2012 《食品中污染物限量》［17］規定的食品中BaP 限量要求，參考谷物、肉類及水產品中的5 ng／g，對中草藥中該成分進行分析，測得其超標率為33%。

表2 9 種中草藥中多環芳烴殘留量（ng／g）Tab.2 Residues of PAHs found in nine kinds of Chinese herbal medicines（ng／g）

3 結論

本研究采用超聲輔助液液萃取-HPLC 法檢測了9 種中草藥中18 種多環芳烴的殘留量，發現均檢出多環芳烴，其中陳皮中總量最高，荷葉、川牛膝、甘草中全部檢出。該方法簡便快速，靈敏度、準確度較好，具有較高的回收率，適合于中草藥種植、生產和加工過程中多環芳烴的監測，可為其質量控制提供依據。