黃蜀葵子脂肪酸鑒定及3 種成分測(cè)定

武晶芳梁 茜江 帆?李 明安崇惠林 婧

（1.貴州師范大學(xué)，貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴陽(yáng)青青生物科技有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550001）

黃蜀葵子為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic 的種子，性味甘、寒、滑，功效利水、消腫、通乳，治淋病、水腫、乳汁不通、癰腫、跌打損傷、骨折等［1］，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材［2］，主要分布于江蘇、廣東、廣西、福建、湖南、湖北、河南、云南、貴州、四川、山東、河北、陜西等地［3］。《本草綱目》 中記載，黃蜀葵的花冠、種子、葉、莖、根均可作藥用［4］；對(duì)于黃蜀葵花、莖葉等有較多報(bào)道［5-8］，其中黃蜀葵花已收載于2015 年版《中國(guó)藥典》［9］，而黃蜀葵子作為地方標(biāo)準(zhǔn)藥材已收載于青海等地的地方標(biāo)準(zhǔn)中［10］，但尚不完善，目前它作為新增品種擬納入《貴州省中藥民族藥地方標(biāo)準(zhǔn)》 中。近年來，對(duì)黃蜀葵子的研究主要集中在資源、化學(xué)成分、脂肪酸組成等方面［11-13］，但在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、方法學(xué)方面尚未見報(bào)道，故本研究對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)研究，以期為該植物質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 5975 型氣相色譜儀-7890 型質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；G5 氣相色譜儀、FID 檢測(cè)器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ACCULAB 型電子天平（萬分之一，深圳市郎普電子科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水式多用真空泵（上海亞榮科技有限公司）；FW135 型中草藥打粉機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；HS21-4-S 電熱恒溫水浴鍋（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 材料 棕櫚酸甲酯（純度99%，批號(hào)952890）、油酸甲酯（純度99%，批號(hào)259364）、亞油酸甲酯（純度95%，批號(hào)283791）對(duì)照品均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；苯甲酸苯酯（純度99%，批號(hào)C10090827）對(duì)照品購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

從貴州省遵義、都勻和貴陽(yáng)采集了8 批樣品，均為基地種植，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院江維克教授鑒定為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic.，標(biāo)本保存于貴州師范大學(xué)分析測(cè)試中心；另從河南網(wǎng)購(gòu)了2 批樣品。具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯對(duì)照品105.3、109.9、101.0 mg，各置于10 mL 量瓶中，正己烷溶解并定容至刻度，搖勻，即得（質(zhì)量濃度分別為10.53、10.99、10.10 mg／mL，僅供GC 含有量測(cè)定用）。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取苯甲酸苯酯1.508 8 g，置于50 mL 量瓶中，正己烷定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度為30.176 0 mg／mL）。

2.1.3 供試品溶液 取樣品約1 g，精密稱定，90 ℃下石油醚（沸程60～90 ℃）索氏提取5 h，至索氏提取器中的液體澄清無色，定容至50 mL，作為脂肪酸提取液。

精密量取脂肪酸提取液3 mL，置于10 mL 具塞試管中，減壓回收溶劑，得到脂肪油，加入2 mL氫氧化鉀甲醇溶液（0.5 mol／L），在60 ℃水浴中皂化25 min 至油珠消失，放冷，加入2 mL 10%三氟化硼甲醇溶液，60 ℃水浴甲酯化2 min，放冷，精密加入2 mL 正己烷，搖勻，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，搖勻，靜置，取上層溶液，即得。

2.2 脂肪酸GC-MS 鑒定

2.2.1 測(cè)定方法 采用Agilent HP-FFAP 色譜柱（50 m × 0.2 mm，0.3 μm）；載氣99.99% 氦氣，體積流量1 mL／min；溶劑延遲時(shí)間2 min；進(jìn)樣口溫度270 ℃；程序升溫（初始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃／min 升至230 ℃，保持5 min）；不分流進(jìn)樣。電子轟擊離子源（EI）；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m／z29～550。分別精密吸取供試品、內(nèi)標(biāo)溶液各1 mL，混合均勻，取1 μL 進(jìn)樣，總離子流色譜圖見圖1，通過NIST05.L 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定，確定脂肪酸組成，并按內(nèi)標(biāo)歸一化法計(jì)算各批次脂肪酸含有量。

2.2.2 結(jié)果分析 供試品溶液中共鑒定出6 種脂肪酸，分別是棕櫚酸、硬脂酸、8-油酸、油酸、亞油酸、順9，10-甲基十九烷酸，見圖1，其中棕櫚酸、8-油酸、亞油酸（1 號(hào)、3 號(hào)和5 號(hào)峰）為主要成分，對(duì)應(yīng)成分見表2。

表2 脂肪酸GC-MS 鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of fatty acids by GC-MS

圖1 各成分GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of various constituents

分別測(cè)定不同地區(qū)8 批樣品，對(duì)各批樣品脂肪酸含有量進(jìn)行歸一化計(jì)算，均鑒定出6 種，其中不飽和脂肪酸為8-油酸、油酸和亞油酸，占比71.86%；飽和脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸和順9，10-甲基十九烷酸，占比28.14%。黃蜀葵子中主要為棕櫚酸、8-油酸和亞油酸，含有量占比達(dá)92.92%，故可選擇其作為測(cè)定指標(biāo)，見表2。

2.3 3 種成分含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 聚乙二醇TG-WAXMS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.5 μm）；程序升溫，初始溫度 180 ℃，保持 0 min，10 ℃／min升溫至210 ℃，保持1 min，6 ℃／min 升溫至230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；FID 檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣為高純氮?dú)猓w積流量1 mL／min；分流比30∶1；進(jìn)樣量1 μL。

精密吸取對(duì)照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液各1 mL，充分混勻，濾膜過濾，取1 μL，注入氣相色譜儀，色譜圖見圖2。各成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以1 號(hào)峰計(jì)大于3 000。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，每份加內(nèi)標(biāo)溶液0.2 mL，分別置于2 mL 量瓶中，正己烷定容至刻度，搖勻，得到5 個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。以各成分、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），2 種溶液質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知3 種成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品（S1），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各成分、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

圖2 各成分氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（S1），按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各成分、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品（S1），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得各成分、內(nèi)標(biāo)物峰面積比值RSD 小于2.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的樣品（S1）約0.5 g，共9 份，精密稱定，精密加入相當(dāng)于藥材中各成分含有量80%、100%、120%的對(duì)照品溶液，平行3 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝3）

2.3.7 樣品含有量測(cè)定 取對(duì)照品、供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表5。鑒于不同批次單一脂肪酸占比存在較大差異，故以總脂肪酸含有量作為限度指標(biāo)，按平均值下調(diào)20% 計(jì)，暫定本品含脂肪酸總量不得低于23.41%。經(jīng)檢驗(yàn)，10 批樣品均符合上述規(guī)定。

3 討論

本研究建立了黃蜀葵子中棕櫚酸、油酸、亞油酸含有量的測(cè)定方法，并對(duì)10 批樣品進(jìn)行了檢測(cè)，平均脂肪酸含有量達(dá)29.26%，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。近年來，對(duì)黃蜀葵花、黃蜀葵莖葉的藥理活性、提取工藝、指紋圖譜、含有量測(cè)定均有報(bào)道［5-8］，但對(duì)黃蜀葵子的研究較少，主要在種子形態(tài)、化學(xué)成分分析等方面［11-13］，其中林文群等［11］以出油率標(biāo)示了3 批樣品中脂肪酸含有量為31.16%，但僅對(duì)其進(jìn)行了GC 法比對(duì)鑒定對(duì)照品及歸一化計(jì)算含有量；劉杰等［12］采用GC-MS 法進(jìn)行成分鑒定，并用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算3 批樣品中6 種脂肪酸的含有量，總量約為7.39%，與本研究結(jié)果（25.21%～30.27%）相差較大，見表6。研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，由于未對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，排除樣品差異、儀器分析等誤差，其結(jié)果偏低可能與提取條件未經(jīng)優(yōu)化、提取不完全等因素有關(guān)。本研究采用石油醚（60～90 ℃）作為提取溶劑，分別比較了超聲、回流和索氏提取方法，以及粉碎粒度、提取時(shí)間等因素，確定樣品過4 號(hào)篩后索氏提取5 h，平均加樣回收率99.62%～100.18%，平均出油率可達(dá)29.00%，與含有量測(cè)定結(jié)果一致。

表5 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（%，n＝3）

表6 不同產(chǎn)地樣品中脂肪酸比較Tab.6 Comparison of fatty acids in samples from different growing areas

本研究對(duì)貴州產(chǎn)8 批樣品均進(jìn)行了GC-MS 分析，共鑒定出6 種脂肪酸，主要為棕櫚酸、油酸和亞油酸，總含有量達(dá)92.92%。文獻(xiàn)報(bào)道，黃蜀葵子脂肪酸種類為6～11 種［11-13］，這可能與其樣本量大小、測(cè)定方法、色譜條件等因素有關(guān)。近期研究表明，在高溫狀態(tài)下GC-MS 用于蒸發(fā)樣品的熱量時(shí)，可降解或轉(zhuǎn)化多達(dá)40% 的所關(guān)注分子的結(jié)構(gòu)［14］，也可能是影響脂肪酸種類的因素之一，故應(yīng)用該方法研究脂肪酸成分是否合理還有待進(jìn)一步考察。

各產(chǎn)地黃蜀葵子中脂肪酸含有量存在差異，可能與生長(zhǎng)環(huán)境，如氣候、光照強(qiáng)度、紫外線等因素有關(guān)；種類均以棕櫚酸、油酸和亞油酸為主，同時(shí)其不飽和脂肪酸占較大比例。研究表明，不飽和脂肪酸是人體內(nèi)不能合成而又必需的脂肪酸，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜功能、維持細(xì)胞因子和脂蛋白平衡等多種調(diào)節(jié)作用［15］，故黃蜀葵子具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。