HPLC 法同時測定小兒香橘丸中4 種成分

楊 璐王麗瓊稅丕先?

（1.西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2.樂山市食品藥品監督稽查支隊，四川 樂山 614000；3.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

小兒香橘丸是由木香、陳皮、蒼術（米泔炒）、炒白術、茯苓、甘草、白扁豆（去皮）、山藥（去皮）、蓮子、薏苡仁（麩炒）、炒山楂、炒麥芽、六神曲（麩炒）、姜厚樸、枳實（麩炒）、醋香附、砂仁、法半夏、澤瀉19 味藥材組成的大蜜丸，功效健脾和胃、消食止瀉，臨床用于治療小兒厭食癥［1］。方中陳皮、枳實（麩炒）以橙皮苷為指標成分，具有溫胃散寒、理氣健脾的作用［2］；姜厚樸主要成分為木脂素（和厚樸酚、厚樸酚）［3］，具有抗腹瀉作用，可促進胃排空和腸推進，常作為該藥材指標化合物［4-6］；醋香附指標成分α-香附酮是其調經解痛的主要有效物質［7］，用于衡量相關制劑質量優劣［8-9］。

中藥質量標準提倡多指標成分含有量測定［10-11］，同時其成分復雜，性質差異大，紫外吸收各異，故采用多波長可實現同時檢測［12-14］。小兒香橘丸現行標準中的含有量測定部分只涉及橙皮苷［15］，不夠完善，故本實驗建立HPLC 法同時測定其中橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮的含有量，以期為該制劑質量標準提供參考；在色譜峰定性上，對保留時間差異不大、光譜相似的組分峰采用選定波長處吸收度比值進行區分，取得了滿意結果，可為復雜組分的色譜峰定性提供一定思路。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器、自動進樣器、OpenLAB CDS 工作站（美國Agilent 公司）；XSE205DU 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；ULUP-II-10T 優普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

橙皮苷（批號110721-201818，純度96.2%）、和厚樸酚（批號110730-201614，純度99.3%）、厚樸酚（批號110729-201513，純度98.8%）、α-香附酮（批號110748-201513，純度99.7%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。小兒香橘丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，每丸3 g，批號15015420、16015811、16015845）。白扁豆、六神曲（麩炒）經樂山市食品藥品檢驗檢測中心朱敏鳳主管中藥師鑒定為正品，其余13 味對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純（北京百靈威科技有限公司）；甲醇（成都市科隆化學品有限公司）、磷酸［重慶川東化工（集團）有限公司］為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品貯備液 精密稱取橙皮苷對照品66.48 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密稱取和厚樸酚對照品13.16 mg、厚樸酚對照品29.08 mg，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密稱取α-香附酮對照品10.05 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液 精密吸取“2.1.1”項下橙皮苷對照品貯備液5 mL、和厚樸酚+厚樸酚對照品貯備液5 mL、α-香附酮對照品貯備液2 mL，置于同一100 mL 量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液 丸劑切碎，每份約取6 g，精密稱定，加入適量硅藻土，研勻，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，稱定質量，超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理1 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液 按處方工藝，制備缺陳皮、缺枳實、缺厚樸、缺香附的陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Welch Ultimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.3%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，20% A；5～15 min，20%～40%A；15～25 min，40%～74%A；25～37 min，74%A；37～38 min，74%～20%A；38～43 min，20%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長250 nm（α-香附酮）、284 nm（橙皮苷）、290 nm（和厚樸酚、厚樸酚）；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖中有與對照品溶液4 種成分對應的色譜峰，相鄰峰分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密量取“2.1.1”項下橙皮苷對照品貯備液4、2、1 mL，和厚樸酚+厚樸酚對照品貯備液4、2、1 mL，α-香附酮對照品貯備液2、1、0.5 mL，分別置于3 個10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取“2.1.2”項下對照品溶液5、2 mL，分別置于2 個10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，另取對照品溶液（未稀釋），以上6 種線性標準溶液在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，并以信噪比（S／N＝10）為定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6 次，測得橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮峰面積RSD 分別為0.8%、1.1%、0.8%、0.6%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 重復性試驗 取丸劑（批號16015845）適量，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮含有量RSD 分別為1.5%、1.7%、1.8%、0.9%，表明該方法重復性好。

2.7 穩定性試驗 取供試品溶液（批號16015845）適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮峰面積RSD 分別為1.3%、1.1%、0.8%、0.9%，表明溶液在常溫下24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取6 份各成分含量已知的丸劑（批號16015845，橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮含有量分別為2.346 8、0.104 6、0.202 2、0.038 2 mg／g），每份約3 g，精密稱定，適量硅藻土研勻后置于具塞錐形瓶中，精密加入“2.1.1”項下橙皮苷對照品貯備液5 mL、和厚樸酚+厚樸酚對照品貯備液1 mL、α-香附酮對照品貯備液0.5 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，共6 份，在“2.2”項色譜條件下各進樣10 μL測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 樣品含有量測定 取3 批丸劑，每批平行3份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量，結果見表3。

表3 各成分含量有測定結果（mg／g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實驗參考各成分紫外光譜圖，選擇多通道檢測，于284 nm 波長處檢測橙皮苷，290 nm 波長處檢測和厚樸酚、厚樸酚，250 nm波長處檢測α-香附酮。甲醇（A）-0.3% 磷酸（B）等度洗脫（60∶40）時，橙皮苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度差，其他3 種成分出峰時間長；梯度洗脫（0～20 min，20%～74% A；20～40 min，74%A）時，橙皮苷色譜峰保留時間約為7 min，與相鄰峰分離度差；梯度洗脫（0～5 min，20%A；5～15 min，20%～40%A；15～25 min，40%～74%A；25～37 min，74% A；37～38 min，74%～20%A；38～43 min，20%A）時，橙皮苷色譜峰保留時間約為9 min，與相鄰色譜峰分離度符合要求，其他3 種成分出峰時間適中，分離度良好。

3.2 色譜峰確認 本實驗以紫外光譜圖特征吸收波長與特定波長處吸收度比值作為成分色譜峰確認依據，發現特定波長處吸收度比值能很好地將相似度較高的紫外圖譜區分開。其中，樣品溶液色譜圖中橙皮苷色譜峰保留時間約為12.8 min，其前后2個色譜峰分別為12.4、13.4 min，三者紫外光譜圖有較高的相似度，無法區分，均在284 nm 波長處有最大吸收，248 nm 處有最小吸收，但橙皮苷色譜峰吸收度比值為7.970，其他2 個色譜峰依次為4.314、7.099，差異明顯，可以區分。

4 結論

隨著藥材種類、產地、代謝節律的影響［16］，有必要對小兒香橘丸主要藥效成分含有量進行控制，而且它作為兒童用藥，相關標準應更嚴格，含有量限度范圍不宜過寬。本實驗采用HPLC 法同時測定小兒香橘丸中橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮的含有量，并采用直接超聲提取，簡便快速，專屬性好，可用于該制劑質量控制。對同一廠家3 批樣品進行檢驗后發現，橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮含有量分別為2.346 8～2.547 0、0.098 2～0.104 6、0.193 0～0.202 2、0.031 9～0.038 2 mg／g，總體上較穩定，但就含有量控制限度而言僅3 批遠遠不夠，今后可考慮收集更多批次樣品以制定其質量標準。