細菌表達dsRNA介導桔小實蠅flightin基因的RNA干擾

袁瑞玲，鄭傳偉，馮 丹，王藝璇，杜春花，陳 鵬

（1.云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南省林業和草原科學院, 云南 昆明 650201；3.興義市林業局，貴州 興義 562400）

【研究意義】RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種廣泛存在于真核生物中高度保守的、由dsRNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解，使相應基因不能表達，從而引發基因轉錄后水平基因沉默的現象［1-3］。dsRNA 導入生物體內后，被細胞中稱為Dicer 的RNase Ⅲ分解成21～23 bp的小干擾RNA（siRNA），siRNA 在沉默復合體（RISC）的作用下與目標mRNA 結合，序列特異性地降解靶mRNA，阻止相應蛋白產物的合成，導致靶標基因的功能喪失。【前人研究進展】RNAi技術已被廣泛應用在基因功能研究、高通量靶標基因篩選、基因治療、藥物靶標預測等領域，對多種農林害中的成功試驗，也證實了利用RNAi進行害蟲防治的可能性和廣泛性［4-5］。RNAi 技術在害蟲防治領域的應用需要大劑量dsRNA，目前最常用的試劑盒合成方法價格昂貴、不能持續生產。利用轉基因寄主植物表達昆蟲源dsRNA對害蟲有一定防效，但植物轉基因難度高、研究周期長，具有很大的局限性。用細菌（如大腸桿菌）表達dsRNA的方法操作簡單，具有成本低且表達產物量大等特點，是基因工程四大表達系統之一［6］。飼喂或注射細菌表達的dsRNA 能顯著干擾甜菜夜蛾［7］、非洲甘薯象鼻蟲［8］等害蟲的生長，證明該技術在植物保護方面的應用潛力。桔小實蠅［（Bactrocera dorsalis（Hendal）］，又名東方果實蠅（oriental fruit fly），屬雙翅目（Diptera）實蠅科（Trypetidea）、果實蠅屬（Bactrocera），是我國二類進境檢疫性害蟲［9-11］，超強的飛行能力使得對桔小實蠅的防治變得困難［12-13］。目前對該害蟲的防治手段主要有人工防治、化學防治及性誘劑的生物防治等，這些手段具有一定的防治效果，但總體存在效率低、成本高、對生態環境不友好的問題。因此RNA 干擾這種靶標性強、環境友好型的技術在害蟲防控領域展現出較大的應用潛力。

【本研究切入點】飛行蛋白flightin是一種大小在20 ku的多磷酸化肌原纖維蛋白，最早是在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）間接飛行肌中被發現［14］。flightin對昆蟲肌肉伸展活化具有重要作用，在間接飛行肌的粗肌絲上與肌球蛋白高度融合，調控和指導粗肌絲的準確組裝和收縮等［14］。選擇飛行蛋白flightin基因作為RNA干擾靶標，破壞昆蟲飛行肌表達通路，阻止昆蟲肌肉伸展活化及肌絲的組裝和收縮等生理過程，可達到害蟲防治的目的。【擬解決的關鍵問題】本研究以L4440 質粒為載體，構建了利用大腸桿菌HT115 表達桔小實蠅flightin-dsRNA的體系，通過對桔小實蠅新羽化成蟲飼喂細菌表達的dsRNA，檢測該方法介導的RNAi 在桔小實蠅中的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲 供試蟲源為云南省林業科學院森保所室內飼養的桔小實蠅種群。飼養條件為：溫度25～30 ℃，濕度60%～70%，光周期L16∶D8。

1.1.2 菌株及質粒載體 大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌HT115（DE3）購自北京華越洋生物科技有限公司，L4440 質粒購自美國 Addgene 機構，含egfp基因的質粒由西南林業大學徐進研究員惠贈。

1.1.3 酶及有關試劑 總RNA提取試劑盒Trizol-A+、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR PremixEx Taq實時熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，TSINGKE Master Mix DNA Polymerase購自北京擎科新業生物技術有限公司，T4 DNA 連接酶、DNase I、RNaseA、限制性內切酶SacI、XhoI購自thermofisher公司，氨芐青霉素（Amp）、X-gal、IPTG購自Amresco公司，鹽酸四環素（Tet）購自solarbio公司，DNA回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，異丙醇、氯仿、無水乙醇等其他分析純試劑購自利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司，引物合成及測序委托北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及反轉錄 桔小實蠅總RNA的提取按照Trizol- A+試劑盒說明書進行。FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄得到cDNA，20℃保存備用，以此作為后續實驗 PCR模板。

1.2.2 引物設計 根據桔小實蠅flightin基因轉錄組序列（GenBank登錄號：XM_011210668），用siDirect（http://design.RNAi.jp/）在線預測可能存在的 siRNA 位點，選擇其中 678 bp 序列作為RNA 干擾片段。用Primer5.0和Oligo6，結合含有T7聚合酶的L4440干擾載體的多克隆位點以及桔小實蠅flightin基因和egfp序列的限制性內切酶位點設計上游和下游引物。上、下游引物的5'端分別加入SacI和XhoI酶切位點。

1.2.3 桔小實蠅flightin基因及對照egfp基因片段的克隆 分別以桔小實蠅cDNA和含egfp基因的質粒為模板，按照TSINGKE Master Mix DNA Polymerase說明書進行PCR擴增，克隆桔小實蠅flightin及egfp基因干擾片段。PCR擴增體系：TSINGKE Master Mix DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物和模板各1 μL，加滅菌ddH2O至總體積25 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。反應結束后，用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DNA回收試劑盒純化回收目的片段送測序。

1.2.4 桔小實蠅flightin及egfp基因的RNA干擾表達載體構建 將L4440質粒與膠回收的桔小實蠅flightin和egfp基因片段分別同時用SacI和XhoI進行雙酶切，37 ℃，1 h，分別回收酶切產物。用T4連接酶將回收的L4440載體分別與flightin、egfp基因片段以1∶3比例室溫連接10 min。連接產物命名為L4440-flightin、L4440-egfp，分別轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。

將轉化的感受態細胞涂布在含Amp、IPTG、Xgal的固體LB平板培養基上，37 ℃過夜培養，挑取白色單菌落于含Amp的LB液體培養基中培養，菌液PCR檢測陽性后，提取重組質粒L4440-flightin和L4440-egfp，用SacI和XhoI雙酶切鑒定，篩選陽性克隆，取陽性克隆菌液送測序。

1.2.5 重組質粒轉化大腸桿菌HT115 用熱激法將L4440-flightin和L4440-egfp表達載體轉入CaCl2法制備的HT115感受態細胞中，涂布于含50 μg/mL Amp和12.5 μg/mL Tet的LB固體培養基上，過夜培養后挑取單菌落接種到Amp和Tet抗性的LB液體培養基中，提取質粒并通過PCR及雙酶切鑒定陽性克隆，重組質粒進一步通過測序進行驗證。

1.2.6 dsRNA在大腸桿菌HT115中的表達 將帶有L4440-flightin和L4440-egfp的HT115菌液接種于Amp和Tet抗性LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，1∶25比例將菌液轉入新的LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養至菌液OD600=0.4左右，加入IPTG終濃度至1.0 mmol/L進行誘導表達，誘導培養4 h后收集菌液。采用TRIzol法提取細菌總RNA，DNase I和RNase A溶液消化純化總RNA，獲得flightin-dsRNA和egfp-dsRNA。

1.2.7 飼喂細菌表達dsRNA的菌液后桔小實蠅flightin基因的RNA干擾 從桔小實蠅羽化開始飼喂IPTG誘導表達靶標dsRNA的大腸桿菌HT115的 10倍濃縮菌液，處理組（飼喂flightindsRNA菌液）和對照組（飼喂egfp-dsRNA菌液）各3個重復，每個重復200頭蟲（雌雄比1∶1）。將濃縮菌液拌進成蟲飼料，每天更換一次新鮮飼料，連續飼喂25 d，處理組和對照組雌、雄蟲分開。

RT-qPCR檢測RNAi效果：采集1、5、10、15、20日齡蟲樣品，3次重復，每個重復各取50頭蟲，分別提取總RNA。熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測RNAi后flightin基因的表達情況，采用2-△△Ct方法計算靶標基因相對表達量。flightin和egfp基因及16S內參基因的qPCR引物如下:

通過飛行能力測試檢測RNAi效果：經過持續飼喂后，分別在5、10、15、20日齡利用佳多飛行磨系統進行雌、雄蟲飛行能力測試，參照袁瑞玲等［15］的方法。

整蟲與胸部組織質量測定：隨機選取待測桔小實蠅各20頭，使用乙醚輕微麻醉后迅速稱量整蟲質量，然后迅速在解剖鏡下去除翅、足、頭、腹等組織，僅留下胸部肌肉組織快速稱量其質量。

試驗數據用SPSS19.0統計軟件進行方差分析，用Duncan氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 桔小實蠅flightin及對照egfp基因干擾片段的克隆

PCR擴增得到含SacI和XhoI酶切位點的桔小實蠅flightin和egfp基因片段，結果為，桔小實蠅flightin基因片段介于500～750 bp之間，對照egfp基因片段介于100～250 bp之間分別與預期添加了酶切位點和保護堿基后的大小692 bp和201 bp相符（圖1 A 3、4泳道）。測序結果與GenBank報道的序列進行比對，無堿基差異，同源性達100%，桔小實蠅flightin基因及egfp基因干擾片段克隆成功。

把載體質粒L4440和膠回收得到的目的片段分別經限制性內切酶SacI和XhoI雙酶切后，2 790 bp的L4440質粒線性化單一條帶約2 755 bp，桔小實蠅flightin及對照egfp基因大小正確（圖1 A 2、5、6泳道）。

2.2 dsRNA表達載體的構建

圖1 flightin和egfp基因干擾片段的克隆及干擾載體的構建Fig.1 Cloning of RNAi fragment of flightin and egfp and construction of RNAi vector

HT115菌株中提取的重組質粒L4440-flightin和L4440-egfp（圖1 B）經SacI和XhoI雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳20 min檢測均分別得到兩條帶，2 755 bp的線性化L4440質粒載體，及678 bp和187 bp左右的flightin和egfp目的片段（圖1 C），表明桔小實蠅flightin基因和對照egfp基因片段成功轉入L4440質粒中，與預期設計一致。雙向測序結果與目的基因序列完全一致，閱讀框正確，說明已經成功構建了L4440-flightin和L4440-egfp干擾表達載體。

2.3 飼喂表達目的dsRNA菌液后flightin表達水平

通過連續飼喂表達flightin-dsRNA和egfpdsRNA的菌液后，處理組與對照組相比，在雌、雄蟲中均未產生預期的下調效果，反而出現了不同程度的上調現象。雌蟲在飼喂后1、5、10、15、20 d時全部產生上調，與對照相比分別上調1.15、2.70、2.27、1.02、3.50倍，其中，飼喂后5、10、20 d與對照差異顯著，飼喂后1、15 d與對照無顯著差異。雄蟲飼喂后15 d誘發約43%的下調，而在飼喂后1、5、10、20 d分別誘發1.38、2.77、1.57、2.98倍的上調，其中飼喂后5日齡與對照差異顯著，其余差異不顯著。結果表明，雌、雄蟲均在飼喂后5 d誘發的上調幅度最大。

2.4 飼喂表達flightin-dsRNA菌液后對飛行能力的影響

連續飼喂表達flightin-dsRNA和egfp-dsRNA的菌液后，5、10、15、20、25日齡的雌、雄蟲飛行能力測試結果（圖3）顯示，在飛行距離上各日齡處理組與對照組差異不明顯。結果表明，飼喂表達flightin-dsRNA的大腸桿菌菌液對桔小實蠅進行RNA干擾，對其飛行能力沒有明顯影響。

圖2 熒光定量PCR分析桔小實蠅flightin基因表達水平Fig.2 Expression level of flightin from Bactrocera dorsalis by real-time quantitative PCR

圖3 飼喂表達dsRNA菌液后桔小實蠅飛行距離Fig.3 Flight distance of Bactrocera dorsalis after feeding bacterial expressing dsRNAs

2.5 飼喂表達flightin-dsRNA菌液后胸部組織與整蟲鮮重比

根據桔小實蠅飼喂菌液進行RNAi后flightin基因的表達量測定結果，選取上調幅度較大的5日齡雌、雄蟲稱量其整蟲與胸部組織的鮮重，得到胸部與整蟲的鮮重比。結果顯示，處理組雌、雄蟲鮮重比分別為34.64%和36.53%，與對照組雌、雄蟲鮮重比的34.39%和35.99%沒有差異，認為飼喂菌液進行RNAi對胸部肌肉發育無影響。

3 討論

諸多研究報道，利用大腸桿菌HT115（DE3）工程菌表達dsRNA是經濟、高產的方法。早在1998年，Timmons等［16］就開始利用HT115表達的dsRNA喂食線蟲，結果靶標基因的表達受到抑制。RNaseIII是細菌中普遍存在的dsRNA 特異性核酸內切酶，由rnc基因編碼，HT115 菌株為rnc-突變不能降解自身合成的dsRNA。HT115經過修飾，插入一個λDE3噬菌體衍生物，可通過IPTG誘導表達T7 RNA聚合酶。HT115的四環素和Amp抗性，可在培養過程中分別排除rnc+反突變體和空載質粒。L4440載體序列的多克隆位點兩側各有1個相反方向的T7 聚合酶啟動子，轉入HT115 菌株后，可經IPTG 誘導表達dsRNA。

隨著細菌表達dsRNA技術的不斷成熟，該技術在包括桔小實蠅在內的多種昆蟲研究中得以實現，有效沉默了目的基因表達［6-7,17-20］。在玉米上噴施表達菌液可抑制花葉病毒的感染［21］，在桔小實蠅精子形成相關基因lola、topi、rac、rho、upd和magu研究中，飼喂表達dsRNA的大腸桿菌干擾后，成功降低了基因表達水平并導致精子質量和數量的下降，產卵量及孵化率受干擾而降低［22］。利用該質粒構建的重組質粒可以在大腸桿菌HT115（DE3）中表達大量所需的外源目的dsRNA，在RNAi研究中，該方法比利用試劑盒體外轉錄和化學合成，能夠大大降低實驗成本，而且通過誘導表達目的dsRNA飼喂昆蟲達到RNAi的操作相對簡單易行［6,18］。然而，直接飼喂也存在一些問題，Li等［6］直接喂食桔小實蠅Noa、Rab11、V-ATP-D和Rpl19基因表達dsRNA的大腸桿菌后，成功降低了基因的表達水平，但部分出現上調現象。Liu等［23］研究表明，桔小實蠅成蟲長期飼喂dsRNA或表達dsRNA的大腸桿菌菌液，靶標基因均會出現表達上調現象，導致該現象的機制尚不明確。在其他昆蟲中不能成功干擾靶標基因的例子也鮮有報道，如黑腹果蠅飼喂表達dsRNA的酵母未能沉默靶標基因表達，對果蠅3種亞種飼喂RNAi體系同樣未實現目的基因的沉默等［24-25］。

本研究結果表明，桔小實蠅飼喂表達flightin基因dsRNA的大腸桿菌未造成預期的目的基因轉錄水平的下調，也未造成飛行能力的減弱或影響發育等，分析認為，未能成功沉默靶標基因的原因可能有：飼喂法對于桔小實蠅存在對RNAi的非基因特異性免疫耐受機制，有關桔小實蠅RNAi免疫耐受研究發現，dsRNA攝取由胞吞機制調控，其間會受到阻遏而無法進入細胞［26］；飼喂表達dsRNA大腸桿菌后導致靶標基因上調，存在應激機制及抗性可能是造成這一現象的原因之一［27-28］，很多刺激源（包括大腸桿菌）會激發桔小實蠅siRNA通路；Zambon等［29］發現果蠅在抗病毒過程中，出現基因表達上調，結果證實病毒激發了IMD、Toll-way和Jak-STAT的信號通路；不同物種中腸環境差異導致RNAi效率也不盡相同；攝取dsRNA劑量不合適，飼喂法由昆蟲自主取食，無法保證其攝取量而影響RNAi效率，也無法確定引發RNAi的dsRNA劑量；桔小實蠅flightin基因在飼喂后1日齡時表達最高，成蟲開始飼喂RNAi基本已經過了該基因表達高峰，飼喂法錯過最佳干擾時間；有研究表明基于飼喂法的RNAi效率普遍低于注射法［30］，本課題組已通過體外轉錄合成flightin-dsRNA注射桔小實蠅，成功下調了flightin基因的表達，降低了成蟲的飛行能力（待發表）；也有大量研究表明dsRNA介導的RNAi在雙翅目中具有效率不高和持效性差等諸多問題［28］。

4 結論

采用RT-PCR技術克隆桔小實蠅Bactrocera dorsalis（Hendel）flightin基因片段，并以此為靶標，設計有效的干擾片段，以線蟲RNAi干擾載體L4440為載體，成功構建了桔小實蠅flightin基因RNAi載體。轉化大腸桿菌HT115（DE3）菌株，利用IPTG誘導表達flightin基因對應的dsRNA。通過飼喂表達flightin-dsRNA的大腸桿菌，桔小實蠅flightin基因的表達出現了不同程度的上調；該方法對桔小實蠅飛行能力及胸部肌肉發育未產生明顯的影響。未能成功沉默flightin靶標基因的具體原因有待后續研究進一步探明，利用飼喂表達flightin基因dsRNA的大腸桿菌方法對桔小實蠅flightin基因進行RNA干擾的可行性還需進一步確認。