農業氮污染治理技術中脫氮菌的研究進展

潘永亮，黑 亮，黃 徐，劉 雯，蔡名旋

（1.水利部珠江河口動力學及伴生過程調控重點實驗室/珠江水利委員會珠江水利科學研究院，廣東 廣州 510611；2.仲愷農業工程學院環境科學與工程學院，廣東 廣州 510225）

氮素是植物生長不可缺少的元素［1］，因此氮肥被大量投入農業生產之中。投放大量氮肥可以保證農作物產出，但是相當一部分氮肥會隨著土壤流失［2］及地表水滲透［3］，造成水環境中氮污染問題。氮在水中的含量較高時，水就變成氮污染廢水［4］，它不僅破壞土壤的種植能力［5］，還會導致水體富營養化［6］，使水變得腥臭渾濁，造成魚類大面積死亡［7］，對農業生產力造成巨大影響［8］，氮元素會在人體內通過亞硝化作用轉換成亞硝酸鹽［9］，長期飲用氮污染水會誘發高鐵血紅蛋白癥狀和癌癥［10］，對人們健康產生嚴重威脅。楊志輝等［11］、鄭翔［12］通過數學模型計算，發現農業造成的氮污染問題已經對我國的生產效率、就業、經濟衰退等問題產生了嚴重影響。由此可見，大量使用氮肥之后造成的氮污染廢水對我們的生活產生了嚴重威脅，治理刻不容緩。蔡彥明等［13］、陳鴻展等［1］一致認為農業氮污染治理分為源頭控制、過程削弱、污染治理3個部分。首先是投放氮肥時必須合理科學，減少氮肥浪費；其次是在污染途徑中建立緩沖帶，削弱氮污染濃度，最后是治理污染水體，達到治理效果［14］。但前兩部分可以通過人們的行為進行控制，而重污染水體卻無法自身治理，因此本文從治理氮污染廢水方面進行探究，尋求農業氮肥污染廢水的治理方法，減少農業工程化對我國環境造成的影響。

目前，氮污染廢水處理技術主要有吹氮法、離子交換法、折點氯化法、生物脫氮法、化學沉淀法等［4］，其中生物脫氮法因其操作容易、效果相對穩定、不產生二次污染等優勢，吸引著學者們的研究［15］。脫氮菌是生物脫氮技術的根本，推進脫氮菌的發展進程，對治理水體氮污染具有重要意義。自從生物脫氮技術興起后，許多學者便致力于從不同環境中篩選出高效脫氮菌，并探究其性能，這對生物脫氮技術治理農業問題有著重要意義。本文主要從脫氮菌的脫氮機理、分離鑒定、影響因素及實際應用等方面進行綜述，總結各種高效脫氮菌生存環境的相似之處，為未來高效脫氮菌的研究提供參考，并對脫氮菌的發展進行論述，對生物脫氮技術治理農業問題進行展望。

1 脫氮菌的定義及脫氮機制

1.1 脫氮菌定義

脫氮菌是指在生物脫氮過程中參與脫氮反應的菌株。脫氮過程一般可分為氨化過程、硝化過程和反硝化過程［16］，參與氨化過程的菌稱為氨化細菌，參與硝化過程的菌稱為硝化細菌，參與反硝化過程的菌稱為反硝化細菌。但氨化過程在一般水體中均能完成［17］，因此本文對氨化細菌不予論述。

1.2 脫氮機理

脫氮菌的脫氮機理如圖1所示，廢水中存在以有機氮、氨氮、亞硝態氮、硝態氮等形式的氮，在反應過程中，氨化細菌會將有機物轉化成NH4+；然后在有氧條件下，硝化細菌會將NH4+轉換成 NO2-，再轉化成 NO3-；而在缺氧條件下，反硝化細菌會將NO2-和NO3-還原成無毒害的N2［19］。

圖 1 脫氮菌的脫氮機理Fig.1 Nitrogen removal mechanism of denitrifying bacteria

2 脫氮菌的分離、鑒定和脫氮效率研究

脫氮菌對環境適應能力強，生長發育時間短，對現實氮污染的治理有著重要作用。邵媛媛［19］用篩選出來的脫氮菌XP1來加強人工濕地的治理，效果十分顯著，強化后的人工濕地對COD的最大去除率達到73%，對氨氮的去除率達到94%，對總氮的去除率達到78%，高氨氮污水經過治理后達到一級標準，治理時間比強化前縮短至少15 d。山東某養殖場池水氨氮嚴重超標，池中的蝦出現了各種疾病，造成蝦大量死亡，武和英［20］對此進行生物脫氮研究，投放多種菌株進入受污池水中48 h后，池水氨氮已經達到養殖標準，其中菌株DZYC02效果顯著，氨氮去除效率高達96%，池水受污染的問題得到了解決；黃國鑫等［21］利用脫氮菌修復地下水，可見脫氮菌有十分可觀的研究前景。脫氮菌包括硝化細菌和反硝化細菌，下面分別對硝化細菌和反硝化細菌的分離鑒定和脫氮效率進行討論。

2.1 硝化細菌的分離鑒定和脫氮效率研究

2.1.1 硝化細菌的分離鑒定 細菌的鑒定分為形態學鑒定、生理生化鑒定和基因測定［22］。形態學鑒定就是觀察菌株的狀態和形態，掌握高效硝化細菌的形態規律，以識別菌株是否為硝化細菌，然后通過《伯杰細菌分類手冊》進行生理生化鑒定［23］，最后通過基因測序鑒定菌株的種類。革蘭氏染色法［24］是鑒定菌株中一種簡單方便的方法，不僅能用來觀察菌株形態，還能鑒別菌株。為了研究高效脫氮菌的規律，本文對這些高效硝化細菌的鑒定方法進行對比，由高效硝化細菌的形態學觀察與革蘭氏染色法的結果（表1）可知，高效硝化細菌的菌落狀態多為帶顏色的圓形不透明菌株，屬桿狀菌，革蘭氏染色結果呈陰性。

表1 高效硝化細菌形態學特征與革蘭氏染色結果Table 1 Morphological characteristics and Gram staining results of efficient nitrifying bacteria

2.1.2 硝化細菌的脫氮效率研究 隨著生物脫氮技術的日益發展，許多學者致力于篩選出更多脫氮效果好的硝化細菌，近年來在不同環境下篩選出的硝化細菌及其脫氮效率見表2。其中，有的菌株對某個氮污染指標的去除效率特別高，有些甚至達到100%，可見其對氮污染治理有著非常好的效果。

表2 高效硝化細菌的脫氮效率Table 2 Nitrogen removal efficiency of efficient nitrifying bacteria

2.2 反硝化細菌的分離鑒定和脫氮效率研究

2.2.1 反硝化細菌的分離鑒定 由高效反硝化細菌形態學特征及革蘭氏染色法的結果（表3）可知，高效反硝化菌和硝化菌的研究結果差距不大，菌株狀態多為帶顏色的圓形，屬桿狀菌，革蘭氏染色結果基本呈陰性。由此可以看出，大多數脫氮菌為桿狀菌，菌落狀態為有顏色的圓形菌落，革蘭氏染色法呈陰性。

表3 高效反硝化細菌形態學特征與革蘭氏染色結果Table 3 Morphological characteristics and Gram staining results of efficient denitrifying bacteria

2.2.2 反硝化細菌的脫氮效率 許多學者從不同環境中篩選出高效反硝化細菌，其脫氮效率如表4所示。由表4可知，大多數高效反硝化菌株的脫氮效率都高于90%，有些菌株的脫氮效率甚至達到100%，也有一部分高效反硝化菌株對于氨氮及硝態氮的去除率很高，但對于總氮的去除率一般。

表4 高效反硝化細菌的脫氮效率Table 4 Nitrogen removal efficiency of efficient denitrifying bacteria

3 影響脫氮菌生長的因素

每種菌株都有其最適宜的生存環境，在最佳培養條件下，菌株的性能、活性、繁殖能力大大提升［45］，探究影響菌株生長的因素，是找到最佳培養條件的關鍵。研究影響脫氮菌生長的因素對廢水中氮污染的治理非常重要。影響脫氮菌生長的因素有碳源、溫度、溶解氧、pH、碳氮比、轉速、微量元素和有毒物質等［45］。

3.1 硝化細菌影響因素

3.1.1 碳源種類 任何生物的發育都離不開營養物質和能量，脫氮菌也不例外。碳源是脫氮菌的營養物質和能量來源。王瑩［33］篩選出的高效脫氮菌WY-01，分別用乙醇鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丙酮酸鈉、丁酸、丁二酸鈉、蘋果酸鈉、延胡素鈉和檸檬酸鈉作為碳源進行研究，結果發現以丙酮酸鈉和檸檬酸鈉為碳源時，脫氮效果最高，達到97%；陳小嵐［28］篩選出的JB4，在以乳糖、蔗糖、丙酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、乙醇、乙酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為碳源的研究中發現，丁二酸鈉為碳源時的效果最好，氨氮去除率達到86.08%；孔慶鑫［31］用二酸鈉、乙酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉作為碳源分別對YY-5進行培養，發現YY-5在含乙酸鈉、琥珀酸鈉的培養基中脫氮效果最好，氨氮去除率達到100%；而王娟［26］篩選出來的YS-6以碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉作為碳源時，發現以碳酸鈣和碳酸氫化鈉為混合碳源的效果最好，氨氮去除率達到最高（88.1%）。以上幾個高效脫氮菌中的最佳碳源都不相同，而且有些菌株是單氮源，有些適合混合氮源，因此最佳碳源方面仍需進一步深入研究。

3.1.2 主要因素 除碳源外，碳氮比、溫度、pH等因素都會影響到菌株的脫氮效率，因此，探究這些因素對脫氮菌的應用前景具有重要意義。從表5可以看出，幾乎所有硝化細菌的適宜碳氮比都在10左右，其中YN3和YY-5適宜碳氮比較高，分別為15和14；幾乎所有硝化細菌適宜溫度都在30～35℃，只有耐冷菌對溫度要求不一樣，如M-8的最適溫度為2℃；幾乎所有硝化菌生存環境都為中性或弱堿性，但有的硝化菌對pH的適應范圍較寬，如HN-S，它在pH為5～9之間脫氮效果都比較理想；所有硝化菌的脫氮效率都高于90%，其中YY-5的脫氮效率最佳，幾乎可以完全去除水中氮污染。這些學者們篩選出的耐受能力強的菌株，不僅在培養時有更強的生命力，而且對于實際水體的耐受能力也強，更容易推進生物脫氮技術治理農業氮肥污染的進程，對生物脫氮技術的發展有著重要的意義。

表5 硝化細菌最佳條件研究Table 5 Optimal conditions for nitrifying bacteria

3.2 反硝化細菌影響因素

3.2.1 碳源種類 在反硝化細菌的研究中，碳源的作用更為強大，在反硝化反應過程中，碳源不僅為菌株提供營養物質，有機碳還為反硝化反應提供能源和電子［46］。李紫惠［39］發現的高效反硝化細菌XH02，分別使用丁二酸鈉、葡萄糖、蔗糖和檸檬酸三鈉為碳源進行最佳碳源的研究，發現以檸檬酸三鈉為單一碳源時效果最好，對亞硝態氮和硝態氮的去除率分別為100%和94.8%；孫智毅［37］對培養出的菌株S1分別以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、延胡索鈉、蘋果酸鈉為碳源進行研究，發現最適碳源是丙酮酸鈉，18 h的脫氨氮效率達到99.1%；劉勝格［41］發現的FX-11的碳源更為廣泛，以乙酸鈉、葡萄糖、淀粉為碳源時，它對總氮的去除率在80%以上，但以酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、纖維素等為碳源時對總氮的去除率低于50%。

在本次研究中，我們還發現一株能以苯為碳源的菌株PDB3，它以苯為唯一碳源時，在最適條件下對苯的去除率高達100%，對總氮的去除率為52.3%［47］。這表明某些脫氮菌不僅能治理廢水中的氮污染，還能治理其他污染因子，對污水治理有重要的潛在價值。

3.2.2 主要因素 從反硝化細菌最佳條件（表6）可以看出，這些反硝化菌適宜碳氮比在3.0～14.9之間，其中G16X-D適宜碳氮比最小、為3，ADH1適宜碳氮比最大、為14.9；大多數反硝化細菌最適溫度在30～35℃之間，但DL-23和ADH1適宜溫度較高、為37℃；這些反硝化菌適宜pH值在5.7～9.0之間，大多數都比較適應弱堿性環境，只有G16X-D可以適應酸性環境；大多數反硝化菌的脫氮效率都在90%以上，其中ZH-1的脫氮效率最高、為100%。由此可見，大多數脫氮菌的最適碳氮比在8左右，溫度在30℃左右，喜歡中性或弱酸弱堿性環境，這為未來脫氮菌的培養提供了的理論依據。

表6 反硝化細菌最佳條件研究Table 6 Optimal conditions for denitrifying bacteria

3.3 其他因素

除了碳源及主要因素外，菌株生存環境其他因素（如水體中其他污染、重金屬、鹽度等）也會影響其生長。路澤洋［48］探究了重金屬Cu和Zn對脫氮菌效率的影響，當Cu濃度為0.05 mmol/mol時脫氮效率迅速下降，Cu濃度為0.1 mmol/mol時基本喪失脫氮能力；而在Zn濃度低于0.5 mmol/mol時，Zn對脫氮反應有促進效果，但是高于0.5 mmol/mol便開始抑制。王洪娟［49］發現隨著鹽度增加，污水中有機物和氨氮降解速率明顯降低。因此，學者們在實驗室篩選出高效脫氮菌后，探究其對外界因素的耐受能力也是很有必要的。

4 脫氮菌的應用

4.1 單菌脫氮應用研究

在傳統脫氮工藝上，硝化過程和反硝化過程分別在不同的反應池中進行。但隨著學者們對脫氮菌的致力研究，越來越多同步硝化反硝化菌株被發現，王永紅等［50］在養殖水體發現了能同步硝化反硝化的菌株j-1，在最適條件下對亞硝態氮、硝態氮和氨氮的去除率均在99%左右；白潔等［51］在沼液中發現菌株GK-1也有同步硝化反硝化能力，在最佳條件下對氨氮的去除率為99.08%，對硝態氮的去除率為96.12%。這表明具有同步硝化反硝化能力的菌株，能在同一個反應器中達到脫氮效果，大大節約了工程占地面積和成本，促進了脫氮菌工業化應用發展。

4.2 混合菌脫氮應用研究

混合菌的研究分為3種情況，第一種是硝化細菌之間的混合研究，第二種為反硝化細菌之間的混合研究，第三種是硝化菌與反硝化菌之間的混合研究。劉勝格［41］在淤泥中篩選出FX-2和FX-11兩株高效反硝化細菌，FX-2在最佳條件下對總氮的去除率為73.15%，FX-11在最佳條件下對總氮的去除率為81.34%，將兩個菌混合，在最佳條件下對總氮的去除率達到90%，說明菌株之間會有協同作用，在沒有競爭的環境下，比單菌株的脫氮能力更強。Deng等［52］將篩選出來的高效反硝化菌SC221-M和BSC24投入養殖水體進行脫氮實驗，9 d后發現BSC24的脫氮率為24.5%，SC221-M的脫氮率為26.6%，效率均非常低，但是將SC221-M和BSC24混合后投放，脫氮效率達到了53.9%，效率是單菌株的2倍。司文攻［27］將篩選出來的硝化菌HN-S和反硝化菌DN-S進行組合探究，在最佳條件下，發現兩種菌組合之后脫氮能力明顯加強，對總氮的去除率達到94.3%，可見，在菌株間沒有競爭的情況下，混合菌的脫氮效率比單菌株要高。如圖2所示，就處理水體氮污染效果而言，單一菌株＜同步硝化反硝化菌＜多種硝化細菌的復合＜多種硝化菌與反硝化菌的復合；就實用性而言，單一菌株＜同步硝化反硝化菌＝多種硝化細菌的復合＜多種硝化菌與反硝化菌的復合，但并不是所有菌株組合起來都能加強其脫氮效果，因此混合菌的應用仍需進一步探究。

5 結語

農業工程化推動了我國農業進步，大大提高了農業生產力，但背后造成的影響不可忽視，在經濟發展的同時，環境治理問題仍是我國未來研究的重點。生物脫氮技術的核心是高效脫氮菌，高效脫氮菌可以從很多環境中篩選出來，如污水處理廠中的污泥、地浸場軸孔的浸出液及人工濕地的土壤等，但由于自然界的復雜性導致并不是每種菌都能適用于自然水體，而且在流動水域中菌株隨水流失的影響，使脫氮菌的實際應用變得更為棘手，因此需要對脫氮菌的實際應用進行更為廣泛的研究，尋找合適載體和脫氮菌固定化技術將成為未來研究的重點。

影響脫氮菌性能的因素有很多，除本文探究的因素外，還有其他因素會影響脫氮菌的脫氮效果。在已知因素方面，我們要進一步探究其影響規律和脫氮菌適宜條件規律。同時探究是否還有其他影響脫氮菌性能的因素，進一步研究脫氮菌的最佳脫氮條件。混合脫氮菌比單菌更適合應用于現實治理問題，研究各種菌之間的組合、配比，發現更多的高效菌株組合，對推動生物脫氮技術治理農業污染問題的進程有積極影響。

圖2 脫氮菌實際應用效果對比Fig.2 Comparison of actual application effects of denitrifying bacteria

目前許多菌株的研究只停留在實驗室階段，并不能適用于自然水體，篩選出耐受能力更強，更符合自然環境的菌株，對治理氮污染廢水具有重要意義。