姬松茸液體發酵培養基篩選和條件優化研究

侯憲文，符瑞益，徐 林，文少白

（1.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所/海南省熱帶生態循環農業重點實驗室，海口 海南 571101；2.海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海口 海南 571199）

【研究意義】姬松茸（Agaricus blazeiMurill）又稱巴西蘑菇、柏氏蘑菇和小松菇。屬于擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇科蘑菇屬［1］。姬松茸口感脆嫩，營養豐富，含有活性多糖體、蛋白質、維生素B1、維生素B2、煙堿酸等，具有增強免疫系統功能、降血糖、降血脂、調節血壓、改善肝功能、抗過敏反應等功效［2］。因此，姬松茸作為一種珍稀的食藥兼用真菌，在食品加工、醫療衛生領域具有廣闊的開發和應用前景［3］。【前人研究進展】傳統的姬松茸培養采用固體栽培法，但其對于固體栽培的環境條件要求嚴格，培養周期長，子實體產量低且不穩定，易受氣候變化的影響。采用液體發酵培養姬松茸菌絲體，則可把生產周期縮短到15 d內，而且生產工藝簡便，培養材料易得，產品質量易于控制，生產成本大幅度下降［4］。鄒祥等研究表明，在初始pH 5.5、250 mL搖瓶裝液量50 mL、接種量15%、溫度26℃的培養條件下，姬松茸深層發酵結果最佳，胞外多糖最高可達 3.48 g/L，搖瓶發酵實驗測定，姬松茸適宜發酵周期為108 h［5］。劉冬華等研究發現，在葡萄糖2.5%、玉米淀粉2.0%、麥芽粉1.2%、豆餅粉1.2%、硫酸鎂0.1%、磷酸二氫鉀0.3%，采用500 mL錐形瓶，pH自然、裝量80 mL、培養溫度25℃、轉速200 r/min的條件下培養10 d，姬松茸發酵培養情況最佳，胞內多糖產量達到7.028 mg/mL［6］。【本研究切入點】目前，關于姬松茸液體發酵的研究主要通過評價發酵后的胞多糖產量，且研究大多集中在對碳源、氮源、碳氮比、無機鹽、生長因子和 pH值等條件的單因素優化上。在實際發酵培養中，單因素之間是相互影響的，因此研究姬松茸液體發酵的多因素影響，對摸索姬松茸液體發酵的最適條件具有重要意義。【擬解決的關鍵問題】本研究擬對姬松茸液體發酵過程中的碳源、氮源、pH值以及無機鹽等發酵條件進行單因子優化，根據單因子發酵結果進行正交組合實驗，以姬松茸發酵后菌絲量的干重為評價指標，確定姬松茸液體發酵最佳條件，為姬松茸進一步深層發酵和應用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

姬松茸菌（中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所保存的菌種IPPI-ABM-03），菌種以菌棒保存，實驗中將菌棒中的菌接種到PDA固體斜面培養基上純化，擴繁。

PDA固體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 姬松茸液體培養 從純化、擴繁的姬松茸菌株固體斜面取菌，將其接種至PDA固體平板培養基，25℃培養5 d，隨后用無菌打孔器（直徑0.5 cm）從長滿菌絲體的平皿培養基上取菌種塊，接種至裝有100 mL滅菌液體培養基的250 mL三角瓶中，25℃、150 r/min振蕩培養5 d后，測定菌絲體生物量。每個處理設置3個平行樣。

1.2.2 菌絲體生物量（菌絲體干重）的測定將發酵液用烘干至恒重的孔徑為0.15 mm銅網過濾，濾網上的菌絲團經去離子水沖洗3～5遍，隨后將銅網和菌絲體置于烘箱中，60℃烘干至恒重，冷卻后稱重，記為M1，過濾前烘干至恒重的銅絲網質量記為M0，則液體發酵后菌絲體干重為M1-M0。

1.2.3 單因素實驗 （1）不同碳源對姬松茸菌絲量的影響。將PDA培養基中的葡萄糖分別更換成相同質量的羧甲基纖維素鈉（CMC）、甘露醇、可溶性淀粉和蔗糖，配置成不同碳源的液體發酵培養基，考察不同碳源下姬松茸的菌絲生長情況。（2）不同氮源對姬松茸菌絲量的影響。每100 mL液體PDA培養基中分別加入0.3 g的氯化銨、硫酸銨和硝酸鉀，配置不同氮源發酵培養基，考察不同氮源下姬松茸的菌絲生長情況。（3）不同pH值對姬松茸菌絲量的影響。用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉分別將PDA液體培養基的pH值調節至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以自然條件的PDA液體培養基為對照，考察不同pH值下姬松茸的菌絲生長情況。（4）其他營養元素對姬松茸菌絲量的影響。在100 mL液體PDA培養基中分別加入0.05 g維生素B2、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉等營養物質，考察添加不同營養元素對姬松茸菌絲生長的影響。

1.2.4 正交實驗 根據單因素實驗結果，對不同碳源種類（葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉）、氮源（氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀）、pH（5.0、5.5、6.0）、其他營養元素（硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉）進行正交試驗，確定最適發酵培養基，選用正交表L9（34），以菌絲體生物量為考察指標，詳見表1。

表 1 正交實驗因素水平Table 1 Combination of factors in orthogonal test

試驗數據采用 Excel 2013進行處理統計，采用Origin 8.0進行作圖處理。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對姬松茸菌絲量的影響

碳是構成菌體細胞和發酵產物分子的主要骨架成分，常用的微生物碳源種類很多，主要有無機碳化合物（CO2、CO32-）、碳氫化合物（甲烷、石蠟）及各種碳水化合物（糖類、淀粉、纖維素）等［7］。本試驗分別以葡萄糖、CMC、甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖為碳源，比較培養液中姬松茸的生物生長量，結果見圖1。以甘露醇為碳源時，姬松茸菌絲干重最大、達到0.3427 g，葡萄糖和可溶性淀粉次之。因此，本試驗選取甘露醇、葡萄糖和可溶性淀粉進行正交實驗。

圖1 不同碳源對姬松茸菌絲干重的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on dry weight of A.blazei mycelium

2.2 不同氮源對姬松茸菌絲量的影響

氮是微生物生長不可缺少的營養元素之一，其既是菌體的構成元素，也是代謝產物中氮源的來源。本試驗分別以氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源，以普通PDA液體培養基為空白對照，考察不同氮源下，姬松茸菌絲量生長情況。結果（圖2）發現，添加不同氮源后，姬松茸菌絲量明顯高于空白對照，其中以硝酸鉀為外加氮源時效果最好，菌絲干重達到0.4718 g。后續研究選用氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀進行正交實驗。

圖2 不同氮源對姬松茸菌絲干重的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on dry weight of A.blazei mycelium

2.3 不同pH值對姬松茸菌絲量的影響

圖3 不同pH值對姬松茸菌絲干重的影響Fig.3 Effects of different pH on dry weight of A.blazei mycelium

有研究表明，姬松茸菌絲能在 pH值為3.5～9.5的基質中生長［8］。本試驗設計了液體培養基的pH值范圍為5.0～7.0。從圖3可以看出，當pH值為5.0～6.0時，姬松茸菌絲生長最好。因此，后續研究選擇pH值為5.0、5.5、6.0進行正交實驗。

2.4 其他營養元素對姬松茸菌絲量的影響

除基本的碳源、氮源外，姬松茸菌絲的生長還需要一些礦質元素和其他營養元素［9］。本試驗營養元素的添加對姬松茸菌絲生長均有促進作用（圖4），其菌絲干重明顯高于對照，其中硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉的效果優于維生素B2，后續研究選取硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉進行正交實驗。

圖4 其他營養元素對姬松茸菌絲干重的影響Fig.4 Effects of other nutrients on dry weight of A.blazei mycelium

2.5 液體發酵培養基及條件優化

根據液體發酵培養基的正交實驗結果及極差分析（表2）可知，本試驗各因素對姬松茸菌絲產量的影響由大到小依次為碳源、營養元素、pH值和氮源，最佳因素水平組合為A1B2C3D3。根據姬松茸液體發酵培養最佳條件進行3次平行培養試驗，姬松茸菌絲干重為0.4463±0.0132 g。確定的最佳培養條件與正交實驗中的產量最高組合接近，且重復性良好，從而可以確定姬松茸液體發酵培養條件：葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、磷酸二氫鈉為其他營養元素，液體初始pH值為6.0。

表 2 正交組合結果及極差分析Table 2 Orthogonal combination results and range analysis

3 討論

食用菌液體發酵培養是一個復雜過程，影響菌絲生長的因素很多，主要有碳源、氮源、溫度、pH值、無機鹽等營養元素［10］。陳博文等研究繡球菌的液體發酵工藝條件表明，以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源時對菌絲的生長速率和胞外多糖產量影響最大［11］；張學秋等研究表明，以蔗糖為碳源、牛肉膏和酵母膏（質量比1∶1）作為復合氮源時，蟬擬青霉多糖含量和菌體干重均最高［12］。因此，不同種類真菌對碳源、氮源的要求不同［13-14］。本研究中，姬松茸在單因子發酵實驗中，以甘露醇為外加碳源時，姬松茸菌絲量最大，其次為淀粉、葡萄糖和蔗糖。而在研究外加氮源的影響時，添加硝酸銨時姬松茸菌絲量最大，其次為硫酸銨和氯化銨，與前人研究結果存在差別。但前人研究選擇的碳、氮源大多為純天然來源的有機碳源和氮源，成分較為復雜，而本研究主要選擇結構確定的化合物作為碳、氮源，因此與前人結果存在差異。

在食用菌的液體培養中，pH 值是重要的影響因素之一［15］。康林芝等［16］以菌絲體生物量為檢測指標對金耳液體發酵條件進行研究，結果表明金耳菌在pH值為3.0～6.0的條件下均能生長，且pH值為5.0時菌絲量達到最大。劉青娥對褐環粘蓋牛肝菌進行液體發酵條件研究考察其產多糖的能力，結果表明pH值在5.6時產糖量最大［10］。本研究中姬松茸在pH值為5.0時，菌絲量產量最高，這與前人結果基本一致，食用真菌在偏酸性環境中生長較好。

此外，礦物質營養元素也是微生物生長必不可少的成分，對真菌生長、代謝物的合成和分泌有十分重要的作用［17］。VB1和VB2對桑黃菌絲體發酵生長有著不同的促進作用，并具有協同效應。在PDA培養基中分別添加0.3 g/L VB1和VB2進行發酵，菌絲體產量提高，且多糖產量也提高［18］。本研究選用的4種營養物質均能提高姬松茸的菌絲產量，磷酸二氫鈉效果最好，且3種無機鹽的效果均優于維生素B1，這可能是無機鹽在發酵過程中起到調節滲透壓、氧化還原電位等作用，添加少量無機鹽能促進菌絲體的生長。

4 結論

本研究通過單因素實驗和正交實驗優化了姬松茸液體發酵培養的碳源、氮源、pH值和其他營養元素，得到其最優組合，即在25℃條件下，以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、磷酸二氫鈉為其他營養元素，液體初始pH值為6，培養5 d，100 mL發酵液中姬松茸菌絲干重為0.4463（±0.0132）g。本研究探索的姬松茸液體發酵條件，能實現姬松茸菌絲的快速生長，提高姬松茸菌絲生長量。相對于固體培養，時間更短，菌株發育更快，為進一步發酵提取姬松茸胞外多糖、實現其大規模工業化生產、擴大發酵培養提供技術支持。