CO2倍增對鐵皮石斛光合特性和生長的影響

何 梅，章金輝，王再花，李 杰，葉廣英，葉慶生

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631）

【研究意義】CO2施肥技術(shù)是實現(xiàn)人工栽培溫室植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要手段之一，隨著設(shè)施栽培產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，設(shè)施內(nèi)CO2施肥作為一項高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病的技術(shù)手段越來越受到人們的關(guān)注。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）作為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其人工繁育和栽培技術(shù)不斷成熟，但品質(zhì)和產(chǎn)量仍參差不齊。CO2作為植物光合作用的原料，研究CO2施肥情況下鐵皮石斛的光合特性、生長和有效成分的變化，對促進鐵皮石斛生長與改良其產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。【前人研究進展】鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生草本附生植物，以莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津等功效，富含多糖、氨基酸、菲類、聯(lián)芐類等70余種化合物，具有抗腫瘤、抗氧化和增強免疫力等作用［1-2］。鐵皮石斛的弱光適應(yīng)能力較強，具有明顯的陰生植物特征［3］，但鐵皮石斛對環(huán)境中CO2的要求較高，CO2補償點和CO2飽和點都比較高［4］。大量研究表明，增加CO2濃度可顯著提高葡萄、大豆、水稻、小麥等植物的生物量和產(chǎn)量［5-7］，也能促進番茄果實、黃瓜、甜瓜中可溶性糖和淀粉的積累［8-10］。劉漢峰等［11］曾報道CO2濃度倍增能提高鼓槌石斛和金釵石斛的日均凈光合速率和水分利用效率。Cho等［12］也發(fā)現(xiàn)增加CO2濃度能提高蝴蝶蘭品種的開花質(zhì)量，但高CO2濃度下鐵皮石斛等蘭科藥用植物生長、有效成分和產(chǎn)量變化尚不清楚。

【本研究切入點】近年來，鐵皮石斛在我國的種植范圍迅速擴大，主要以大棚栽培和仿野生栽培為主，種植面積已超過6 700 hm2，產(chǎn)業(yè)規(guī)模達百億元［13］，但有關(guān)鐵皮石斛栽培中CO2處理的研究還鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究參考前人在鼓槌石斛、蝴蝶蘭和非洲菊上等植物上報道的CO2濃度（800 μmol/mol）［11-12,14］，通過倍增鐵皮石斛栽培環(huán)境中的CO2濃度，評估鐵皮石斛光合特性的動態(tài)變化，以及處理180 d后鐵皮石斛生長、有效成分和產(chǎn)量的變化，為提高其產(chǎn)量與品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用秋季分蘗的鐵皮石斛（D.officinale）秋芽為試驗材料，株高4～5 cm，單株葉片數(shù)4～5片，長勢良好，玻璃溫室中栽培1個月。

1.2 試驗方法

試驗于2016年5月1日至10月25日（處理時間共180 d）在廣州華南師范大學(xué)蘭花研究中心進行，玻璃溫室頂端覆蓋遮陽網(wǎng)（遮陽率75%），環(huán)境溫度24（± 1）℃，相對濕度80%左右。栽培基質(zhì)為樹皮∶木炭∶小石子∶紅磚細石 =4∶2∶1∶1，環(huán)境因子由浙江求是公司記錄儀實時監(jiān)控并記錄（每隔0.5 h記錄1次）。溫室內(nèi)CO2由鋼瓶供給（純度95%，廣州氣體廠提供）。選取長勢一致的鐵皮石斛苗，參考前人報道的最佳CO2處理濃度［11-12,14］，每天7:00—17:00進行CO2倍增處理，CO2濃度為倍增的大氣CO2濃度800（±50）μmol/mol，以大氣CO2濃度400（±50）μmol/mol作對照，每個處理45盆，3次重復(fù)。每盆每周施用200 mL 0.5 g/L德國進口COMPO肥1次（N∶P2O5∶K2O = 30∶10∶10），每隔2 d澆水1次。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 葉片光合指標 分別于處理后0、10、20、30、60、90、120、150、180 d隨機取長勢健康的第4片完全展開的功能葉（從植株頂端往下數(shù)）進行光合、形態(tài)及各項生理生長指標的測定，上午9:30—11:00，利用LI-6400便攜式光合測定儀（北京力高泰科技有限公司）分別測定CO2處理和對照的鐵皮石斛功能葉的光合指標，包括凈光合速率（Pn）、細胞間隙CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、水分利用效率（WUE）等，流速設(shè)定為500 mL/min。

1.3.2 生長相關(guān)參數(shù) 處理180 d后隨機選取對照和CO2倍增處理植株各50株（5個重復(fù)，每個重復(fù)10株），分別測定單株苗的莖高、莖粗（電子游標卡尺測量）、葉片數(shù)、莖鮮質(zhì)量、莖干質(zhì)量（105 ℃殺青15 min，80 ℃烘至恒重）、單葉面積（杭州綠博YMJ-A葉面積儀測定）、比葉面積SLA（單葉面積/單葉干重）和葉片厚度（石蠟切片觀測，金華科迪KD-2260石蠟切片機）。

1.3.3 葉片可溶性蛋白含量 參考Bradford［15］的方法略加改進。稱取0.1 g葉片剪碎于冷凍過的研缽中，加入1 mL磷酸緩沖液（pH 7.8）和少量石英砂，在冰浴中快速研磨成勻漿，勻漿倒入離心管中，再用4 mL的磷酸緩沖液將研缽中的勻漿洗入離心管中。在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液倒入10 mL的容量瓶中，殘渣加入5 mL磷酸緩沖液懸浮再離心，將上清液倒入容量瓶中混勻，定容至10 mL待測。取0.3 mL樣品提取液，加入0.7 mL磷酸緩沖液（pH 7.8），再加5 mL考馬斯亮藍G-250試劑顯色，搖勻，放置2 min，利用UV-2550 分光光度計測定595 nm吸光值。以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線。

1.3.4 有效成分含量 鐵皮石斛莖的多糖含量測定參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）中的苯酚－硫酸法［16］，總生物堿含量測定參照章金輝等［17］報道的方法，總黃酮含量測定參考Amri等［18］的方法，以蘆丁為標準品繪制標準曲線。

總氨基酸含量測定參考魯芹飛［19］的方法稍作改進：取0.3 g干燥的鐵皮石斛莖段粉末，置于具塞試管中，加入6 mol/L鹽酸10 mL，110 ℃烘箱中水解24 h，冷卻過濾，濾液移至25 mL容量瓶，加水定容，然后量取10 mL移至25 mL容量瓶中，用30% NaOH調(diào)至中性，加水定容至刻度。取樣液2.0 mL置25 mL試管中，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液和1.0 mL 2%茚三酮，搖勻，沸水浴30 min，冷卻加水定容至25 mL，利用UV-2550分光光度計測定570 nm吸光值。以天冬氨酸為標準品繪制標準曲線。

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進行統(tǒng)計處理并作圖，利用SPSS軟件進行LSD差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2倍增處理對鐵皮石斛光合特性的影響

由表1可知，CO2倍增處理和對照的鐵皮石斛葉片凈光合速率（Pn）前期均逐漸增加，在處理后20 d達到最大值后稍有下降，并維持相對穩(wěn)定的水平，這表明光合速率隨著葉片的生長而相應(yīng)提高，且CO2倍增處理的Pn顯著高于對照；處理后30 d，CO2倍增處理和對照的Pn分別為5.57、3.84 μmol/（m2·s），差異達到最大。同時，在CO2倍增處理的180 d期間，鐵皮石斛沒有出現(xiàn)“光合適應(yīng)”現(xiàn)象。

整體上看，CO2倍增處理對鐵皮石斛葉片的胞間CO2濃度（Ci）沒有顯著影響（表1），CO2倍增處理及對照在30 d時均達到最大值且差異顯著，CO2倍增處理的Ci比對照增加7%，在倍增處理150～180 d期間，鐵皮石斛葉片的Ci與對照總體上沒有顯著差異，并均維持在一個相對穩(wěn)定的水平，這可能與CO2倍增處理顯著增加鐵皮石斛葉片的Pn有關(guān)。

表1 CO2倍增處理對鐵皮石斛葉片凈光合速率、胞間CO2濃度和氣孔導(dǎo)度的影響Table 1 Effects of doubling the CO2 concentration on net photosynthetic rate，intercelllular CO2 concentration and stomatal conductance in leaves of D.officinale

CO2倍增處理也顯著增加了鐵皮石斛葉片的氣孔導(dǎo)度（Gs），平均增加20%，其中CO2倍增處理60 d后Gs達到最大值，為0.056 mol/（m2·s），比同期對照顯著增加27%。氣孔導(dǎo)度的增大必然會導(dǎo)致蒸騰速率（Tr）的增加。由表2可知，CO2倍增處理鐵皮石斛葉片的Tr顯著高于同期的對照，平均增加21%，其中CO2倍增處理的前30 d，對照和處理葉片的Tr均顯著增加，在30 d時達到最大值，CO2倍增處理為1.35 mmol/（m2·s），比同期對照顯著增加35%。隨后，Tr呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，在60 d時比30 d下降13.45%，但仍然高于同期的對照。

植物水分利用效率（WUE）能在一定程度上反映植物的耗水性和抗寒性。CO2倍增處理20 d和30 d，鐵皮石斛的WUE均超過對照，但差異不顯著；CO2倍增處理60 d后，鐵皮石斛的WUE顯著高于同期對照，且呈逐漸增加的趨勢；CO2倍增處理120 d，鐵皮石斛的WUE出現(xiàn)最大差異值，比對照顯著提高47%。雖然在CO2倍增條件下，鐵皮石斛葉片的Tr總體上高于對照，但CO2倍增增加光合同化CO2的物質(zhì)的量（Pn）的幅度遠大于其引起的蒸騰散失H2O的物質(zhì)的量（Tr）的幅度，進而使得CO2倍增處理的WUE在 60 d后就一直顯著高于對照（表2）。

表2 CO2倍增處理對鐵皮石斛葉片蒸騰速率、水分利用率和可溶性蛋白含量的影響Table 2 Effects of doubling the CO2 concentration on transpiration rate，water use efficiency and soluble protein content in leaves of D.officinale

2.2 CO2倍增處理對鐵皮石斛葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表2可知，鐵皮石斛單位葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著栽培時間的延長而呈增加趨勢，但CO2倍增處理90 d前增加不顯著。CO2倍增處理90 d后，對照和處理均出現(xiàn)顯著增加并維持在一個穩(wěn)定水平，但CO2倍增處理的增幅顯著大于對照，在120 d達到最大值4.37 mg/g（FW），比對照提高19%。

2.3 CO2倍增處理對鐵皮石斛生長的影響

由表3可知，CO2倍增處理對鐵皮石斛的生長有顯著影響。在試驗處理180 d后，CO2倍增處理的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均顯著高于對照，分別增加30%和13%。CO2倍增雖然對莖粗無顯著影響，但莖高顯著增加49.3%（圖1）。同時，CO2倍增處理的單株葉片數(shù)和葉片厚度也顯著增加、分別提高42%和3.5%，但鐵皮石斛的單葉面積和比葉面積顯著降低、分別下降11.8%和20%。

表3 CO2倍增處理對鐵皮石斛生長的影響Table 3 Effects of doubling the CO2 concentration on growth of D.officinale

圖1 CO2倍增處理180 d 后鐵皮石斛的生長情況Fig.1 Growth of D.officinale after doubling the CO2 concentration for 180 d

2.4 CO2倍增處理對鐵皮石斛有效成分含量的影響

從表4可以看出，CO2倍增處理能夠影響鐵皮石斛有效成分的含量。CO2倍增處理180 d后，鐵皮石斛莖中的多糖、生物堿、總氨基酸和總黃酮含量均有一定程度的提高，但與對照無顯著差異。

表4 CO2倍增對鐵皮石斛有效成分含量的影響Table 4 Effects of doubling the CO2 concentration on the contents of effective components of D.officinale

3 討論

CO2作為植物光合作用的原料之一，其濃度的增加有利于提高植物的凈光合效率，促進植物其他相關(guān)代謝活動的進行［20］。前人研究發(fā)現(xiàn)，在CO2倍增條件下，植物的凈光合速率提高了19%～68.2%，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率有所下降，提高了瞬時水分利用率［21-24］。本研究中，CO2倍增處理顯著增加了鐵皮石斛葉片的氣孔導(dǎo)度（Gs），CO2倍增處理60 d達到最大值，這可能與鐵皮石斛生境的相對濕度較高有關(guān)，水分是影響氣孔運動的最主要的外界因素，在相對濕度較高的情況下，Gs會相應(yīng)增大。即使在倍增條件下，胞間CO2濃度依然較低，植物提高氣孔導(dǎo)度以便獲取更多的CO2進行光合作用。

長期CO2倍增作用下植物會出現(xiàn)“光合適應(yīng)”或“光合下調(diào)”現(xiàn)象［25-26］。對大豆［27］、金釵石斛［28］等的研究發(fā)現(xiàn)，這些植物在長期CO2倍增作用下并沒有出現(xiàn)“光合適應(yīng)”現(xiàn)象。本研究中，CO2倍增大大提高了鐵皮石斛的光合能力，也沒有出現(xiàn)“光合適應(yīng)”現(xiàn)象。

大部分植物在長期CO2倍增條件下都會出現(xiàn)葉片可溶性蛋白質(zhì)含量下降的現(xiàn)象，如蝴蝶蘭［21］、芥菜［23］等。但另有研究表明CO2倍增引起大豆可溶性蛋白質(zhì)含量增加，原因可能是豆科植物具有根瘤菌，能夠從空氣中獲取氮素，以適應(yīng)植物在高CO2濃度下快速生長對氮素的需求［29］，但大多數(shù)非豆科植物并不具備這種功能。CO2倍增降低植物體內(nèi)N濃度的機制還不大清楚，有學(xué)者提出CO2倍增提高了N的獲取，并在一定程度上促進植物生長［30］，單國雷等［31］也發(fā)現(xiàn)CO2倍增增加了西瓜可溶性蛋白質(zhì)含量。本研究中，CO2倍增處理后期（120～180 d），鐵皮石斛單位葉片可溶性蛋白質(zhì)含量顯著增加，這可能是由于CO2倍增條件下鐵皮石斛生長較快，有機物積累增多，第4片功能葉為倍增條件下新長的葉片，加上施用的高氮肥滿足了鐵皮石斛新葉對N的需求，從而促進了可溶性蛋白質(zhì)的積累。

Centritto等［32］研究發(fā)現(xiàn)，CO2倍增促進了白楊葉片的生長，增加了葉片的數(shù)量，但對葉面積沒有顯著影響。本研究中鐵皮石斛的葉片數(shù)和葉片厚度顯著增加，但其單葉面積和比葉面積明顯降低。鐵皮石斛莖的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量分別顯著提高30%和13%；莖高顯著增加49.3%，但對鐵皮石斛的莖粗沒有顯著影響。葉面積的減少有利于減少蒸騰速率進而提高植物的水分利用率。對同一物種，比葉面積的下降有助于植物在獲取更多光能的同時保證自身不受強光的傷害［33］。

CO2倍增會誘導(dǎo)植物的營養(yǎng)組分發(fā)生變化，如初級生產(chǎn)、營養(yǎng)物在植物不同部位的循環(huán)、化學(xué)成分的比例和可食用部位的產(chǎn)量等［34-35］，進而改變作物的營養(yǎng)價值。H?gy等［36］對春小麥進行了3年CO2施肥的研究發(fā)現(xiàn)，CO2施肥后春小麥的地上生物量增加了11.8%，谷物產(chǎn)量增加了10.4%，但CO2加富后谷物顯著變小，谷物中的蛋白質(zhì)顯著下降，因而引起氨基酸含量下降。Mamatha等［37］對番茄進行700 μmol/mol CO2施肥，發(fā)現(xiàn)CO2施肥增加了番茄的氨基酸含量，但CO2加富后的總酚、總黃酮、抗氧化物質(zhì)和番茄紅素含量都出現(xiàn)了下降。鄭金英等［8］發(fā)現(xiàn)，CO2加富能夠促進番茄果實中淀粉的轉(zhuǎn)化和還原糖的積累，較高濃度的CO2能夠促進果實生長前期合成類酶活性的增強和后期蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的增強，且800 μmol/mol處理下成熟期果實中還原糖含量最高。張志鵬等［9］認為800 μmol/mol CO2時最經(jīng)濟實用，該倍增處理使可溶性固形物含量增加了6.7%，蔗糖含量增加了12.7%，果糖含量增加了6.0%。本研究中，CO2倍增處理同樣也是采用800 μmol/mol的CO2，與對照相比，鐵皮石斛莖的多糖、生物堿、總氨基酸和總黃酮含量均有所提高，但差異不顯著。由于本次試驗材料為鐵皮石斛一年生莖，CO2倍增處理和對照的莖多糖含量暫未達到藥典的標準［16］，而隨著栽培時間的延長，鐵皮石斛莖中的多糖含量會不斷積累，絕大部分鐵皮石斛莖多糖積累量的高峰值出現(xiàn)二年生莖中，而鐵皮石斛有效成分含量的后續(xù)變化將有待進一步研究。

4 結(jié)論

CO2倍增處理能夠提高鐵皮石斛的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和水分利用率，而處理180 d后，鐵皮石斛主要藥用部位莖的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和高度均顯著增加，從而提高了莖產(chǎn)量，但莖的多糖、生物堿、總氨基酸和總黃酮等有效成分的含量與對照無顯著差異。