乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群變化研究*

邢樂康，鄧永東，姚立瓊，金鳳玲

肝硬化是臨床常見的慢性肝病，乙型肝炎病毒(HBV)感染為該病的主要病因之一。肝硬化后期常引起消化道出血、肝性腦病和腹水等一系列并發癥，導致患者死亡?，F有眾多研究[1]表明乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群會發生變化，并通過“腸-肝軸(gut-liver axis)”[2]使肝臟Kupffer細胞吞噬功能受損和炎癥因子釋放，導致肝臟結構進一步破壞，加重疾病的嚴重程度。有研究表明[3]膳食結構會影響腸道菌群的變化，研究不同地區不同程度乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群變化的特點對治療有重要的意義。本研究分析了乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群的變化特征，旨在為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年7月～2019年4月我院收治的乙型肝炎肝硬化患者103例，男68例，女35例；年齡26～61歲，平均年齡為(46.4±3.1)歲。診斷符合中華醫學會肝病學分會和感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》 (2015年版)[4]的標準，其中代償期41例，失代償期62例。入組患者在納入研究一個月前均未接受抗生素或腸道菌群調節藥物治療。另選擇在本院體檢的健康志愿者20例，男11例，女9例；年齡21～59歲，平均年齡為(44.6±4.1)歲。本研究經蘭州大學第一醫院醫學倫理委員會審核通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 腸道菌群檢測 采用Illumina Miseq高通量測序方法檢測腸道菌群序列(上海凌恩生物技術公司)，并提取高質量序列，對其進行OTU聚類分析和物種分類學分析，分析多樣性指數和群落結構。大致測序過程如下：(1)抽提基因組DNA，完成后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA；(2)進行PCR擴增，按照指定測序區域，合成帶有barcode的特異引物，并在2%瓊脂糖電泳進行檢測。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。使用ABI GeneAmp? 9700型PCR擴增儀；(3)參照電泳初步定量結果，將PCR產物進行熒光定量檢測；(4)構建Illumina PE250文庫。對測序結果進行overlap關系拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，并進行OTU聚類分析和物種分類學分析。在上述分析的基礎上，再對一系列群落結構和系統發育等進行深入的統計學和可視化分析。

2 結果

2.1 菌群結構分布分析 基于門等級水平，通過研究共鑒定出15種細菌，其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)分別占總數的62.3%和26.2%，其次為梭菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，共占比為10.7%，而黏膠球菌形菌門(Lentisphaerae)、酸桿菌門(Acidobacteria)、互養菌門(Synergistetes)、廣古生菌門(Euryarchaeota)和奇古生菌門(Thaumarchaeota)等含量極低。在健康人、代償期和失代償期肝硬化組，厚壁菌門和擬桿菌門分別為70.9%和64.2%、57.7%和18.6%，和26.7%和28.9%；在屬分類等級水平上，我們共鑒定出300余種細菌，其中占比最高的為擬桿菌屬(Bacteroides)占14.5%，其次為糞桿菌屬(Faecalibacterium)占10.2%和巨單胞菌屬(Megamonas)占8.4%，而普氏菌屬(Prevotella )、韋榮球菌屬(Veillonella)和羅斯氏菌屬(Roseburia)等占比較低，均小于5%；在健康人，巨單胞菌屬、擬桿菌屬和糞桿菌屬比例較高，分別為14.8%、11.4%和9.8%。在代償期肝硬化組，擬桿菌屬、糞桿菌屬和巨單胞菌屬比例分別為15.2%、11.5%和11.2%。在失代償期肝硬化組，擬桿菌屬、糞桿菌屬和韋榮球菌屬比例分別為16.9%、9.6%和9.2%。

2.2 腸道菌群多樣性分析 在群落生態學中研究微生物多樣性，通過單樣本的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，通常運用Chao指數來計算菌群豐度。Chao指數在生態學研究中常用來估算物種總數，而運用Shannon和Simpson指數來計算菌群多樣性，Shannon指數越高，說明菌群多樣性越高，而Simpson指數越高，說明菌群多樣性越低。研究發現，健康人Chao指數顯著高于代償期肝硬化組和失代償期肝硬化組，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，與健康人群比，失代償期肝硬化患者腸道菌群豐度明顯降低，且失代償期肝硬化患者腸道菌群豐度顯著低于代償期肝硬化患者。經方差分析，健康人Shannon指數顯著低于代償期肝硬化組和失代償期組，差異有統計學意義(P<0.05)。健康人Simpson指數顯著大于代償期和失代償期肝硬化，差異有統計學意義(P<0.05，表1)，而稀釋曲線趨于平坦(圖1)，說明測序結果可反映樣本菌群的多樣性。對樣本進行PCOA分析后發現，大部分失代償期乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群存在聚集，與健康人和代償期肝硬化患者有明顯差異，第一主成分貢獻率為23.7%，第2主成分貢獻率為18.7%(圖2)。

表1 肝硬化與健康人腸道菌群豐度和多樣性比較

與健康人比，①P<0.05

圖1 研究對象腸道菌群稀釋曲線

圖2 研究對象腸道菌群PCOA分析

2.3 腸道菌群差異分析 LEfSE分析方法采用線性判別分析(LDA)估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小，通過分析可以發現組間差異顯著的菌種。本研究在健康人，厚壁菌門中的毛螺菌科Lachnoclostridium屬和Ruminococcaceae科Ruminiclostridium-5屬對菌群差異起到重要作用，在失代償期肝硬化組，厚壁菌門中的Veillonellaceae科Veillonella屬起到重要作用(圖3)。

圖3 失代償期肝硬化患者與健康人腸道菌群差異分析

3 討論

腸道菌群是人體重要的定植菌群之一，有著免疫調節、病原體防御和物質代謝等生理功能。一般，正常腸道菌群分為益生菌、中性菌和有害菌。當菌群結構發生改變時，一些炎癥介質和內毒素的釋放將導致腸道屏障被破壞，引起疾病的發生，且這些有害代謝產物還可通過腸-肝軸運輸至肝臟，破壞其結構和并使其功能受損。對腸道菌群進行調節，現已逐漸成為臨床治療肝臟疾病的有效手段之一[5]。

現有眾多研究表明，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群結構發生改變，且隨著病情的發展而變化[6，7]。本研究結果顯示，相對于健康人群，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群中擬桿菌屬細菌數量呈升高趨勢，厚壁菌門/擬桿菌門細菌比例下降，且與疾病的嚴重程度呈正比，而巨單胞菌屬和糞球菌屬細菌數量下降，在失代償期肝硬化患者中韋榮球菌屬細菌數量上升。該研究結果與國內研究報道基本相似[8]，而國外有學者檢測發現[9]，乙型肝炎肝硬化患者腸道腸桿菌科、梭桿菌科和產堿桿菌科細菌數量上升，而瘤胃菌科和毛螺菌科細菌數量下降。檢測結果可能受到疾病種類和當地飲食習慣的共同影響。巨單胞菌屬和糞球菌屬細菌均可代謝短鏈脂肪酸，調節腸道免疫功能和物質代謝[10]，而現已發現瘤胃菌科和毛螺菌科細菌多數含有膽汁酸水解酶，與次級膽汁酸的產生密切相關[11]，而膽汁酸可以刺激腸壁，破壞腸道微生態和機體免疫功能，影響機體對腸道菌群結構的調節。也有研究發現在肝硬化患者腸道內腸桿菌科和擬桿菌科細菌更豐富，且菌群改變程度與疾病發展程度相關[11-15]。

同樣，飲食習慣因素也能調節腸道微生物的組成。有國內學者提出[16]，脂肪攝入的數量和類型均會影響腸道菌群的組成，而厚壁菌門細菌含有與脂肪或難消化的多糖代謝相關的基因，故這種菌群與肥胖相關，擬桿菌門的作用與其相反，所以在高脂飲食人群中可能會發生腸道內厚壁菌/擬桿菌比值升高的現象。失代償期乙型肝炎肝硬化患者腸道微生物多樣性明顯降低，飲食因素如咖啡、蔬菜和發酵乳的攝入可增加菌群的多樣性，而乳果糖和碳酸飲料的飲用將降低腸道微生物的多樣性[17]。我國漢族人飲食以米、面食和肉類為主，這種高蛋白質及高脂飲食習慣會造成擬桿菌屬細菌數量的上升[18]。

本研究發現，在失代償期乙型肝炎肝硬化患者腸道中韋榮球菌屬豐度上升，而韋榮球菌屬可通過與鏈球菌屬的協調作用，從而釋放內毒素和炎癥因子等，破壞腸道屏障功能[15]，屬于條件致病菌導致的腸道菌群結構失衡。失衡的腸道菌群所產生的代謝毒物等可通過“腸-肝軸”對肝臟結構進一步造成破壞[19-21]，同時腸道動力學的改變和胃腸pH環境變化都會導致肝硬化患者病情不斷加重而向失代償期發展。

綜上所述，乙型肝炎肝硬化患者的確存在不同程度的腸道菌群結構失衡和數量改變現象。隨著病情發展，患者腸道菌群也在發生變化，而菌群失衡常導致病情的加重。目前，有學者提出糞便移植等新興治療方法[17]，這些手段還需要更多的探索和觀察。不同地區乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群特點存在差異，可能與疾病病因、病情、飲食習慣和治療干預等有關。臨床醫生可根據具體情況對乙型肝炎肝硬化患者進行個體化的治療，找到最合適的治療方案，盡可能減少對腸道菌群的破壞，從而達到更好的療效。