PNPLA3對肝細胞和肝癌細胞脂質代謝的影響*

寧寶爍 綜述，李異玲 審校

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種無過度飲酒史的脂肪性肝病。 是常見的慢性肝病之一[1]，表現為肝細胞的胞質中以脂滴形式存在的甘油三酯累積，肝細胞發生脂肪變性、壞死以及炎性細胞浸潤等。突變基因 PNPLA3 I148 M與 NAFLD的發生發展聯系密切，且與非酒精性脂肪性肝炎( nonalcoholic steatohepatitis， NASH)、肝纖維化及肝癌的發生密切相關，與酒精性肝硬化及其所致肝癌的臨床轉歸及預后的臨床轉歸相關。可以推測PNPLA3基因在肝臟脂肪代謝中起著重要作用，其表達水平與脂肪代謝密切相關。NAFLD的發病機制復雜，其確切機制尚未完全明了。 多數研究者認為NAFLD發生的關鍵是能量代謝穩態異常，肝臟甘油三酯合成分解轉化異常導致甘油三酯積聚[2，3]。 國外研究顯示含patatin樣磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain containing 3， PNPLA3)基因多態性與 NAFLD的發生進展有密切聯系[4]。2008年Rome等人發現PNPLA3 I148M基因突變與NAFLD有關[5]。PNPLA3稱為脂肪營養素(adiponutrin)，屬于 patatin樣磷脂酶家族，編碼一種由481個氨基酸組成的可溶性非分泌性蛋白，在 N端包含有高度保守序列 Gly-X-Ser-X-Gly(具體氨基酸位置為 Gly45-Gly49)[6]。

脂肪組織和肝臟是脂肪代謝的主要部位，人屬PNPLA3在肝臟中表達量最高，其次為皮膚和脂肪組織[7，8]。而PNPLA3在小鼠脂肪組織和腎上腺中表達，在小鼠其他組織和器官中基本不表達。 PNPLA3的表達與機體的營養狀況緊密相關。 胰島素和葡萄糖可以刺激脂肪組織中PNPLA3的表達，胰島素含量正常的糖尿病患者的PNPLA3表達水平平均是正常人的兩倍多，如果患者患有高胰島素血癥，而血糖水平正常，這類病人體內的 PNPLA3平均表達量為正常人的5倍左右[9]。 進食情況也可以影響PNPLA3的表達，空腹時表達較低，進食碳水化合物后表達升高。 在動物實驗中，禁食19小時后，PNPLA3表達水平顯著降低，幾乎無法測得。而經過8個小時的恢復進食使其又恢復到初始水平[10]。 食物中不同營養素會影響PNPLA3的表達。 進食大量碳水化合物使小鼠體內 PNPLA3表達水平明顯升高[11，12]，進食高蛋白食物也有同樣的效應， 然而，高脂飲食并不會導致 PNPLA3高表達[12]。 長期食用高脂飲食可以增加某些脂肪因子的表達[13]，而大量的碳水化合物飲食使肝臟中的 PNPLA3 mRNA水平升高了90倍[14]。 對于人類研究，Liu[15]在2004年第一次研究肥胖患者PNPLA3基因表達的調節。 該研究發現肥胖女性和非肥胖女性之間PNPLA3表達水平無顯著差異。 短期或長期的極低卡路里飲食(VLCD)顯著降低PNPLA3的表達，并且再次進食導致PNPLA3表達水平恢復正常。

PNPLA3的結構類似于脂肪組織中的非鈣離子依賴性磷脂酶 A2( patatin-like phospholipase domain containing2， PNPLA2ATGL)， PNPLA2具有甘油三酯脂肪酶和酰基甘油轉酰基酶活性，在脂滴表面催化甘油三酯水解為甘油二酯和游離脂肪酸。PNPLA3的表達對脂肪細胞的分解供能有正向調節作用[15]。

關于 PNPLA3表達調控的機制， Perttil?[16]發現 PNPLA3啟動子區存在碳水化合物反應元件( carbohydrate response element， ChRE)，葡萄糖通過該元件結合蛋白( ChRE binding protein， ChREBP)在轉錄水平調節 PNPLA3的表達;而 SREBP-1(Sterol-regulatory element binding protein 1，SREBP-1)可通過其啟動子區的SREs (Sterol-regulatory elements，SREs)激活PNPLA3基因轉錄。PNPLA3定位在細胞膜與脂滴之間，屬四次跨膜蛋白，可能通過內質網轉高爾基體轉運機制， 從內質網轉運到脂滴，也可能在細胞膜和脂滴之間執行不同功能[17]。為了解I148M多態性對PNPLA3酶活性影響的機制，He[18]進行了體外實驗。三維模型顯示，氨基酸的變化沒有導致酶活性和酶活性中心變化。 而是由于酶分子中蛋氨酸側鏈較長，底物不能與47號位點酶活性中心接觸。 這可能是 I148 M多態性使 PNPLA3失活的機制，表明I148M多態性通過使PNPLA3酶失活而引起疾病。

1 PNPLA3與肝細胞脂質代謝的關系

1.1 PNPLA3與人類肝細胞脂質代謝關系 2008年，通過檢測“達拉斯心臟研究”( Dallas Heart Study， DHS)中9229個來自北美不同種族個體非同義單核苷酸多態性( single nucleotide polymorphism， SNPs)[5，19]，發現肝臟中甘油三酯含量的升高與 PNPLA3基因緊密相關。 此外，與雜合子相比，純合子中肝臟甘油三酯含量是雜合子的兩倍。在這項研究之后，多項研究[20，21]證實人PNPLA3 I148M基因突變與肝臟甘油三酯含量增加密切相關。

脂肪在肝臟中的積累可能是富含甘油三酯的脂蛋白從肝臟釋放入血的過程受到干擾。研究結果表示，在歐亞混血兒人群中，PNPLA3基因突變與apoB載脂蛋白分數密切相關。每個PNPLA3等位基因突變可使apoB載脂蛋白分數下降3%，而在群體中，載脂蛋白分數變異應該小于1%。因此認為PNPLA3可能通過參與餐后肝臟脂蛋白合成過程而參與apoB載脂蛋白的代謝[22-26]。除了apoB載脂蛋白，也有文獻表示PNPLA3突變可通過抑制微粒體的轉運蛋白而影響肝臟的脂肪含量[5]。

PNPLA3參與脂肪合成并且其突變體能使脂肪合成能力提高[27]。調查發現，在11000例歐裔美國人中，PNPLA3突變之后，人體內會發生膽固醇積聚現象，這一關系也在芬蘭人群體中出現。PNPLA3I148M多態性可降低總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)，表明它可能在脂蛋白代謝中發揮作用[28]。這些研究基于來自不同地區和種族的人，可能表明PNPLA3多態性與不同地區和種族人群的肝臟脂肪含量有關。這種差異也可能是不同地區和種族肝臟脂肪含量不同的原因之一。進食導致PNPLA3表達上調，表明PNPLA3參與脂肪合成[7，29-31]。一項針對西班牙兒童和青少年的研究[32]發現攝入高碳水化合物膳食會顯著增加純合子兒童的肝臟脂肪含量[33]。其他研究顯示，PNPLA3 I148M多態性對肝臟脂肪含量的影響存在性別差異。男性和女性的雌激素水平不同，而雌激素是參與脂質代謝的重要激素之一。 性別差異可能源于激素水平的差異，也可能源于基因差異，還有可能是由于二者共同作用，具體機制則需要大樣本人群研究。可以肯定的是，PNPLA3 rs738409基因多態性與NAFLD密切相關，但在NAFLD患者中，PNPLA3的表達與基因型無關[34]。

1.2 PNPLA3與動物肝細胞脂質代謝關系 人類 PNPLA3基因與鼠類 PNPLA3基因僅具有68%的相似性，為了較好地模擬人體內的環境， Eriks Smagris[22]構建了一個更好地反映人體生理狀態的動物模型，他們將蛋氨酸( M)替換了小鼠 PNPLA3基因第148位的異亮氨酸( I)。 結果發現，進行常規飲食，含有 PNPLA3 I148 M基因的小鼠肝臟中甘油三酯含量與野生型小鼠并無顯著差異。高糖飲食4周后，含有PNPLA3 I148M突變基因的小鼠肝臟中的甘油三酯含量顯著高于野生型小鼠。 而且雜合子小鼠肝臟甘油三酯含量介于兩種純合子小鼠之間，但兩種飲食在血脂水平未見明顯差異。 這一結果顯示， PNPLA3并不是小鼠肝臟主要的甘油三酯水解酶，小鼠體內甘油三酯的含量升高是由于產生 PNPLA3-I148 M突變蛋白， 而不是因為野生型酶失活。這表明PNPLA3I148M與NAFLD的相關性來自于獲得的新功能，而不僅僅是簡單的功能喪失。此外，該研究還提示飲食因素在PNPLA3 I148M突變基因誘導肝臟甘油三酯含量增加過程中的重要性。

Li JZ,et al[23]發現過表達PNPLA3 I148突變基因的小鼠中，甘油三酯和膽固醇水平明顯高于野生型小鼠，也驗證了 PNPLA3與甘油三酯含量升高有密切聯系。 PNPLA3 I148M突變后在增加甘油三酯合成的同時降低了甘油三酯中不飽和脂肪酸的比例[23]。 國內有研究發現，感染含 PNPLA3基因腺病毒的小鼠肝臟細胞能有效表達 PNPLA3基因，小鼠 PNPLA3基因明顯增加了胞內甘油三酯含量，但對胞內膽固醇含量沒有影響。PNPLA3基因在小鼠肝臟中的過度表達增加了VLDL中的甘油三酯含量以及血清甘油三酯水平，并且促進肝臟分泌VLDL。但不影響肝臟以及血清中的膽固醇和游離脂肪酸等指標。而小鼠 PNPLA3基因的瞬時敲低不影響血清和肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸等生理指標[24]。Naokikumashiro et al[25]等人用SAO (specific antisense oligonucleotides)作用于高脂飲食的大鼠來降低 PNPLA3的表達，結果發現降低表達可以減輕肝臟脂肪變性，因此推測 PNPLA3脂肪合成活性可能占其主導地位。而PNPLA3在體外具有甘油三酯水解酶的作用，但其在進食碳水化合物時表達量增加。在293 A細胞中過表達小鼠 PNPLA2基因導致胞內甘油三酯水平降低，而過表達小鼠 PNPLA3基因，胞內甘油三酯水平具有增加的趨勢[29]。PNPLA3的表達形式與瘦素的表達形式十分相似，提示它們可能具有相似的調節機制。瘦素缺乏引起的肥胖小鼠脂肪組織中PNPLA3 mRNA的水平降低約2倍。Western檢測表明，大多數PNPLA3分布在細胞膜上，但分布在細胞質中的PNPLA3具有更強的甘油三酯分解能力[30]。這可能是由于與底物的微弱相互作用或翻譯后的修飾調節不同。在酰基轉移方面，將 PNPLA3與 C14標記的甘油一酯共同孵育，合成含有 C14標記的甘油二酯和甘油三酯，提示 PNPLA3參與了甘油三酯的合成過程。此外，除了正常動物的肝細胞，研究發現， PNPLA3 I148M影響大鼠肝癌細胞 McA-RH7777中 VLDL的分泌，這可能是由于甘油三酯動員能力的降低[35-42]。與敲除基因小鼠相比，過表達人PNPLA3 I148M突變基因的小鼠肝臟中，甘油三酯水平升高并且脂肪酸合成能力增強[43，44]。 脂肪變性模型靠正常或蔗糖飲食建立，而不是靠高脂飲食，這表明突變的 PNPLA3對脂肪酸從頭合成起作用， 而不是對重新吸收的未酯化脂肪酸起作用[45]。

綜上所述，結合前述觀點，PNPLA3 I148M突變導致肝臟甘油三酯含量增加的機制可能包括以下幾個方面：1，人體內肝臟脂肪含量與 VLDL和 apoB100的分泌呈正相關[36]， 人肝臟脂肪含量相同時， I148 M等位基因攜帶者的 VLDL分泌速度較慢。且過表達I148M突變蛋白的McA-RH7777細胞表現出細胞內甘油三酯含量升高且apoB分泌較慢，而apoBmRNA的合成及穩定性無明顯差異。這提示我們PNPLA3 I148M變異能通過影響含apoB脂蛋白的分泌及VLDL的酯化促進肝內甘油三酯含量的增加；2，PNPLA3 I148M通過抑制甘油三酯水解酶的活性促進肝臟甘油三酯積聚。進一步的研究發現，通過與甘油三酯水解酶競爭結合 CGI-58， PNPLA3 I148 M能降低甘油三酯水解酶活性，進而導致肝臟脂肪的聚集；3，PNPLA3 I148M通過增強溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)的作用，促進肝臟甘油三酯的合成；4，將PNPLA3I148M基因敲入小鼠肝臟中，肝臟中脂滴含量增加，且脂滴大小顯著增大。他們猜測脂滴表面失活的蛋白可能通過限制脂滴通路阻止甘油三酯的水解，造成肝臟TG的積累。PNPLA3的特定功能可能因不同的靶器官而異，并且仍然存在爭議。它在肝臟中的主要作用體現在甘油三酯水解過程還是合成過程尚無定論。

2 PNPLA3與肝癌細胞脂質代謝的研究進展

在人肝癌細胞系中，SREBP-1c可使PNPLA3表達[39]。在Huh-7細胞實驗中，Huh-7細胞過表達野生型PNPLA3基因，未發現細胞內甘油三酯含量的變化。而過表達 PNPLA3 I148 M引起細胞內甘油三酯含量升高。研究在體外環境中，PNPLA3及I148M變體改變人類肝臟細胞中脂質成分及其合成物成分的機制。他們在Huh-7肝癌細胞系中過表達野生型和突變型PNPLA3，其不表達內源性PNPLA3。 在含有13 C甘油標記的甘油三酯條件下培養細胞，并用17 D標記的油酸進行合成分解實驗。通過質譜儀測量細胞中的甘油三酯，甘油二酯和磷脂。 在存在或缺乏脂肪酸的情況下經過比較他們的亞細胞定位而得到進一步關于野生型和突變型之間功能性差異的證據。 實驗發現，PNPLA3 I148M的表達在沒有改變甘油三酯合成的情況下導致甘油三酯凈積累，但其水解作用延遲； PNPLA3誘導脂肪酸在甘油三酯和膜磷脂之間重新分配； PNPLA3的過表達對肝細胞中PA(磷脂酸)沒有任何影響； 野生型PNPLA3 ，而不是PNPLA3 I148M，增強甘油三酯的重塑； PNPLA3 I148M比野生型PNPLA3聚集更多脂滴。

關于大鼠肝癌細胞 McA-RH7777的實驗中，通過在 McA-RH7777細胞系中過表達人類野生型和突變型 PNPLA3基因來研究細胞內的脂質含量、 apoB的分泌以及甘油酯類的代謝。 結果發現，與過表達 PNPLA3野生型的 McA-RH7777細胞比較，過表達突變型 PNPLA3的細胞內含有更多的甘油三酯， 并且表現 apoB分泌變少、脂肪酸消耗減少，表明過表達突變型 PNPLA3的細胞內，一些與脂質代謝相關功能喪失。 在一項研究一種新型永生人類肝細胞系的脂質代謝特征的實驗中[41]， 人們發現在相同濃度的葡萄糖培養條件下，表達野生型 PNPLA3的人類肝細胞 LIV0 APOLY與表達突變型 PNPLA3的 HepG2細胞相比， HepG2細胞含有更多的細胞內甘油三酯。PNPLA3的敲除并不影響在普通培養基中孵育或經高糖油酸處理的HepG2細胞總脂質含量[45]。與研究一致，在體外，PNPLA3的敲除或過表達都沒有改變細胞甘油三酯含量[29，46]。這也是可能因為我們的PNPLA3敲除導致PNPLA3蛋白水平僅降低了70%，或許不足以誘導表型的改變。