慢性乙型肝炎患者血清鐵調素和鐵代謝指標及體外HBV轉染Huh7細胞鐵調素水平變化*

王兆飛，管世鶴，陳禮文，王 琴，楊 凱，張 浩，候舒文，潘正蘭，段元麗

鐵調素(hepcidin,Hepc)是一種由肝臟合成并分泌的生物活性多肽，也是迄今為止發現的唯一具有負性調鐵作用的生物素[1]。目前，相關鐵代謝與慢性病毒性肝炎的研究主要集中在丙型肝炎[2，3],而對乙型肝炎病毒(HBV)感染者體內鐵調素與鐵代謝變化規律的研究仍存在爭議。為探究CHB患者血清鐵調素和鐵代謝指標變化的臨床價值，我們比較了CHB患者與健康體檢者血清鐵調素和鐵代謝指標的變化，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年4月～9月安徽醫科大學第二附屬醫院治療的慢性乙型肝炎患者71例，男性39例，女性32例；年齡為(36.83±10.08)歲。診斷符合2015年頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，所有患者均未接受過干擾素治療。排除標準: 合并其他病毒性肝炎、肝癌 、遺傳性 、缺鐵性疾病或既往有鐵代謝紊亂疾病的HBV感染者。另選24例健康體檢者，男、女各12例，平均年齡為(35.70±13.24)歲作為對照，經檢測排除各類肝炎的存在，無心、肝、肺、腎等疾病?；颊呓M與健康健康人在年齡和性別方面差別均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 檢測方法 使用全自動生化分析儀(Dimension EXL with LM，德國西門子公司)檢測生化指標；使用全自動蛋白分析儀(BN ProSpec,德國西門子公司)檢測鐵代謝指標【血清鐵(SI)、鐵蛋白(Ferr)、轉鐵蛋白(Tf)】；采用ELISA法檢測血清Hepc(武漢基因美生物公司，美國伯騰儀器有限公司生產的SynergyH4酶標儀，在475nm波長下讀取OD值，并計算鐵調素水平)；使用電化學發光全自動免疫分析儀(Cobas e 601,瑞士羅氏公司)檢測血清IL-6；采用熒光定量PCR法測定血清HBV DNA水平(上海復星醫藥核酸提取試劑盒，Agilent Stratagene，California，USA)。

1.3 細胞培養與質粒轉染 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM對Huh7細胞(上海富亨細胞庫)在37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞，接種于 6孔板，調整每孔細胞數約為1×106。取具備乙型肝炎病毒全基因組的pC1.3質粒1.8 μg，混合脂質載體(Thermo Scientific，USA) 2μL，靜置20 min，轉染接種于6孔板24 h，培養Huh7細胞，達到80%融合；以等量的空載質粒(pBlue-ks)轉染Huh7細胞，作為空白對照，在37℃、5%CO2培養箱中培養6 h，換液，繼續培養24 h和48 h。

1.4 細胞鐵調素mRNA水平檢測 采用RT-qPCR法，在6孔板，分別轉染細胞24 h和48 h，用TRIzol(Thermo Scientific，USA)提取肝細胞總RNA。測量RNA樣品的純度后，根據操作說明，使用逆轉錄試劑盒 (Thermo Scientific，USA)將RNA逆轉錄成cDNA，使用cDNA作為模板，采用PCR法擴增鐵調素基因，引物序列 F: ATGTTCCAGAGGCGAAGGAG，R: CTACGTCTTGCAGCACATCC；選擇β-actin(引物序列F:GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG， R:CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG)作為參考基因。使用Agilent Stratagene M×3000P熒光定量PCR系統進行測定。靶基因引物由安徽欣樂生物科技有限公司設計并合成。

1.5 細胞鐵調素蛋白表達檢測 采用Western blot法，在6孔板轉染48 h，使用裂解緩沖液制備全細胞蛋白裂解物。采用BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度。隨后，加入緩沖液到全細胞蛋白裂解物中(緩沖液與裂解物體積為1：4)。然后，100℃煮沸10 min，使用10%～15%SDS-PAGE電泳分離20 μg總蛋白，并轉移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h。將膜洗滌3次，分別加抗人鐵調素抗體(Abcam，UK)和抗人β-actin抗體(Abcam，UK)，在4℃溫育過夜。洗滌后，將膜與1：5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的抗小鼠或抗兔二抗(北京中山金橋)在室溫下孵育1 h，洗滌。采用化學發光法使蛋白條帶可視化，用顯影儀對顯影蛋白條帶圖進行拍照保存，以并β-actin為內參，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，重復檢測3次。

2 結果

2.1 CHB患者與健康人血清學指標比較 與健康人比， CHB患者血清SI、Ferr、ALT、AST、TBIL和IL-6水平顯著升高，而血清Hepc、Tf、sTfR和ALB水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 不同炎癥活動度CHB患者鐵代謝及鐵調素水平比較 肝組織中度炎癥活動組患者血清SI和Ferr水平顯著高于，血清Hepc顯著低于輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)；重度炎癥活動組血清SI和Ferr水平顯著高于，而血清Tf和Hepc水平顯著低于輕中度活動組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 不同肝組織炎癥活動CHB患者鐵調素和鐵代謝指標【 M(interquartile range)】比較

與輕度炎癥活動組比，①P<0.05；與中度炎癥活動組比，②P<0.05

2.3 HBV感染細胞鐵調素水平變化 在質粒轉染Huh7細胞24 h和48 h后，Hepc mRNA相對水平為(5.21±0.43)，較空載體質粒轉染組的(0.73±0.14)顯著升高；在48 h，病毒質粒轉染細胞Hepc mRNA水平為(8.45±0.61)，較空載體質粒轉染組細胞的(1.16±0.17)顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)；轉染質粒48 h后，轉染病毒組細胞hepc蛋白相對表達量較空白組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 轉染細胞Hepcidin mRNA水平

圖2 轉染48 h細胞Hepcidin蛋白相對表達量

3 討論

已有文獻報道CHB患者體內存在不同程度的鐵代謝紊亂[4]。據本研究結果顯示隨著CHB患者肝組織炎癥活動度加重，患者體內鐵超載進行性加重，有關報道[5，6]研究結果一致。故檢測血清鐵調素水平及鐵代謝相關指標有助于評估CHB患者的病情進展。

HBV DNA載量多用于確定感染性、判斷治療指征、確定耐藥性的出現以及診斷隱匿性HBV感染[7]。ALB和TBIL是體現肝臟合成與轉化能力的指標[8]。本研究結果顯示病毒復制及肝臟合成功能降低與血清鐵調素水平降低顯著相關。然而，在我們構建的HBV感染肝細胞模型中，通過檢測Hepc mRNA及其蛋白的相對表達情況，我們發現在肝細胞感染HBV后鐵調素水平顯著升高，此結果與本研究中發現的CHB患者血清鐵調素顯著降低相矛盾。我們在體外實驗結果證明了HBV感染可刺激鐵調素的表達。既往研究證明HBV感染本身并不會引起肝細胞損傷，而是由HBV感染引起的宿主炎癥反應和T細胞免疫應答所致[9]。所以，體外HBV感染肝細胞后細胞損傷程度遠低于體內，大量的肝細胞損傷會引起肝臟合成能力的降低。血清鐵調素與血清白蛋白的合成有關，說明在HBV感染過程中體內大量肝細胞損傷引起了肝臟對鐵調素合成能力的下降。此外，本研究CHB患者血清IL-6水平升高而鐵調素水平減低，顯示正向調控鐵調素的細胞因子IL-6的升高并沒有引起體內鐵調素的升高，反而出現體內鐵調素水平的減低。這是由于HBV復制引起的免疫反應干擾了體內復雜細胞因子及信號網絡的正常功能[10]，包括STAT3和BMP/SMAD在內共同調控鐵調素表達的多種信號通路受到了影響?？傊?，我們認為在體內鐵調素表達的正調節因子作用可能被負調節因子作用所掩蓋，但具體機制仍有待探索。經以上分析我們推測HBV感染者體內鐵調素表達降低為患者體內鐵超載的重要原因之一【11-15】。

我們的研究證明了檢測鐵調素及其鐵代謝相關指標有助于評估慢性乙型肝炎患者病情進展，并推測出鐵調素持續低水平為導致CHB患者肝內鐵超載的重要原因之一。對于CHB相關鐵超載適當的去鐵治療至關重要。目前，靜脈切開術和去鐵胺輸注已用于臨床治療鐵超載。然而，這兩種方案存在諸多不良反應。我們的研究結果提示提高血清鐵調素水平可以用于HBV感染相關鐵超載的去鐵治療。但人工合成鐵調素不僅價格昂貴且具有一定的藥理學性質成分不宜藥用，近期研究發現使用合成的minihepcidins已經避免了這些問題[16-19]。此外，還可以通過增強內源性鐵調素的產生來提高血清鐵調素水平。目前，已報道的內源性激活鐵調素表達的治療策略有TMPRSS6失活劑[13]和BMP6激動劑[14]兩種。總之，我們不僅可以通過檢測鐵調素及其鐵代謝相關指標幫助評估慢性乙型肝炎患者病情進展，而且適當予以鐵調素或者其相應內源性激活劑可針對性地治療CHB患者相關鐵超載問題，從而延緩病情進展。