慢病毒介導miR-203過表達對酒精性肝病大鼠肝損傷的保護作用及其機制研究*

黃橘村，胡東輝，張建軍，田德英

MicroRNA-203( miR-203)是miRNAs家族中重要的成員。MiR-203位于人染色體14q32.33，該區域屬于不穩定區域，編碼人類約12%miRNA[1]。研究發現，miR-203與腫瘤的發生發展密切相關，miR-203過表達后有抑癌作用[2]。也有研究表明，miR-203對于人類皮膚的形態發育和功能維持有調控作用[3]。目前，關于miR-203的研究很多，但是miR-203對酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)影響的研究還較少。ALD主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化等，其主要的致病原因就是長期過量飲酒。研究發現，ALD與機體的氧化應激、細胞轉化因子表達和炎癥介質釋放等有關[4]。本研究采用慢病毒介導miR-203過表達觀察了ALD大鼠肝組織氧化損傷和炎癥反應的變化，以探討miR-203參與ALD發病的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑 SPF級雄性SD大鼠，體質量180～220 g(由湖南長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物質量合格證編號：43006700005608)。相差顯微鏡(Leica)，多功能酶標儀(Thermo Scientific MultiSkan Go)，PCR分析儀(蘇州東勝興業科學儀器有限公司)，電泳儀電源(Tanon)，全自動生化分析儀(日本日立公司)。紅星二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司，批號：6906785230165)。miR-203慢病毒質粒(上海吉瑪基因股份有限公司)。檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)試劑盒(北京利德曼生化技術有限公司)。檢測超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。抗-actin抗體(PTG)、抗NF-κB和抗IL-1β抗體(Abcam)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime Biotechnology)。

1.2 慢病毒介導的miR-203過表達和ALD大鼠模型的建立[5]取60只SD大鼠，隨機分為A組：即ALD組，B組：即NC-miRNA/ALD和C組：即miR-203/ALD。在建立ALD大鼠模型前，在B組大鼠，使用胰島素注射器通過尾靜脈注射NC-miRNA慢病毒空質粒，作為陰性對照，在C組大鼠，注入miR-203慢病毒表達質粒。在病毒感染后第1 d，給予各組大鼠隨意飲用5%酒精，連續3 d，第4 d換成10%酒精，以后每隔1 w增加2%酒精濃度，直至達到22%酒精。自飲用22%酒精開始，給予54%酒精2 mL.d-1分3次灌胃，連續8 w。

1.3 大鼠肝組織miR-203水平檢測 在造模8 w，麻醉處死大鼠，取肝組織，置于10%福爾馬林溶液中固定，行石蠟包埋、切片、HE染色，并在光鏡下觀察。另取肝組織，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，采用TaqMan Small RNA Assays行miR-203逆轉錄反應，再采用Realtime PCR法檢測，采用2-ΔΔCt法計算miR-203水平。正向引物序列：5’GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3’，反向引物序列：5’-CCAGUGGUUCUUAACAGUUCAAC-3’。

1.4 肝組織勻漿SOD、CAT和MDA檢測 在造模8 w處死大鼠，取新鮮的肝組織勻漿，采用ELISA法檢測。

1.5 肝組織IL-1β和細胞核NF-κB蛋白表達檢測 另取肝組織，分別采用細胞核提取試劑盒或普通組織裂解液裂解肝組織，低溫離心，取上清液采用BCA試劑盒進行蛋白定量，配膠，采用Western Blot法檢測，經瓊脂糖凝膠電泳，轉膜，封閉，加一抗4℃過夜，加二抗孵育2 h，顯影，進行半定量分析。

2 結果

2.1 各組ALD大鼠血生化指標變化的比較 C組動物血清AST、ALT和TBIL水平顯著低于B組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠血清生化指標比較

與其他兩組比，①P<0.05

2.2 兩組大鼠肝組織miR-203水平比較 在構建ALD模型8 w末，經Realtime PCR法檢測發現，C組大鼠肝組織miR-203水平為(2.8±0.1)，顯著高于B組【(1.3±0.5)，P<0.05】，表明慢病毒介導的miR-203過表達ALD大鼠模型成功建立。

2.3 各組肝組織病理學表現比較 A組大鼠肝細胞壞死、空泡變性，有炎性細胞浸潤；B組動物肝組織與A組表現相似；C組大鼠肝小葉內偶見肝細胞壞死，有少量的炎性細胞浸潤(圖 1)，結果表明miR-203過表達對于ALD大鼠肝組織損傷有明顯的保護作用。

圖1 三組大鼠肝組織形態學觀察(HE，×400)

2.4 各組大鼠肝臟組織SOD、CAT和MDA水平比較 C組肝組織SOD和CAT水平顯著高于，而MDA水平顯著低于B組或A組(P<0.05，表2)，說明miR-203過表達能顯著提高肝組織的抗氧化能力，從而減輕肝損傷。

表2 各組大鼠肝組織SOD、CAT和MDA水平比較

與其他兩組比，①P<0.05

2.5 各組大鼠肝組織NF-κB和IL-1β表達情況的比較 經Western Blot檢測結果表明，A組和B組肝組織NF-κB和IL-1β蛋白表達水平均顯著增強，說明導入空載體質粒對于肝損傷無明顯影響。與B組比，C組肝組織IL-1β蛋白和NF-κB蛋白表達明顯減弱(圖2，表3)，說明miR-203過表達后可能通過抗氧化和抗炎作用機制對肝組織起到了保護作用。

圖2 各組肝組織NF-κB和IL-1β蛋白表達比較

表3 各組大鼠肝組織IL-1β和NF-κB蛋白比較

與其他兩組比，①P<0.05

3 討論

MiRNA是現代分子生物學領域里研究的熱點[6]。隨著研究的深入，miR-203的作用逐漸被發現被認知[7-10]，miR-203在皮膚上皮組織生理、病理過程中有著重要的作用。MiR-203具有誘導細胞分化、促進細胞自噬、細胞凋亡和抑癌等作用，其在各種疾病中的具體作用都有待進一步闡明[11-14]。MiRNA203在ALD發病過程中的作用鮮有報道。有研究表明，miR-203對胃癌細胞的遷徙和細胞凋亡均有影響，能夠促進胃癌細胞的凋亡，有抗胃癌的作用[15]。本研究表明，通過慢病毒轉染大鼠miR-203，在大鼠肝臟組織中出現miR-203過表達，并且miR-203過表達后對于肝組織的病理損傷也能起到一定的保護作用。

一般將ALD分為急性和慢性肝損傷，嚴重酗酒或長期大量飲酒都會造成ALD。ALD的具體發病機制比較復雜，目前比較公認的發病機制有：乙醇及其代謝產物對肝臟有直接的毒副作用，乙醇還會誘導細胞發生氧化應激以及脂質過氧化，細胞在氧化應激的狀態下會產生一些內毒素、細胞因子和炎性介質等介導的炎性反應。乙醇可能會使細胞缺氧，進而導致細胞損傷。但是，目前尚未有具體明確的致病機制[16]。在肝臟受到損傷時，ALT和AST會從細胞內滲出，釋放到血液中。血清ALT、AST和TBIL水平升高在一定程度上能夠反映肝細胞損傷的程度[17]。為了考察miR-203對ALD大鼠肝損傷的影響，我們檢測了各組動物血清ALT、AST和TBIL水平，結果C組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平比B組顯著下降，提示miR-203具有保護肝細胞的作用，減輕了ALD動物肝細胞的損傷。ALD的損傷是很多因素共同導致的結果，其中還包括氧化應激反應、炎癥、細胞凋亡、缺氧、細胞因子作用等。在ALD個體，乙醇會改變腸粘膜的通透性，引起胃粘膜損傷，進而抑制SOD和CAT的酶活性，并增加MDA的產量[18]。SOD、CAT和MDA是與細胞氧化應激相關的指標，為了進一步探討miR-203對肝損傷的作用，我們又檢測了肝組織損傷后一些指標的變化，結果發現C組與B組比，肝組織勻漿CAT和SOD含量明顯升高，提示miR-203具有提高機體抗氧化能力。與B組相比，C組大鼠肝組織MDA含量顯著降低(P<0.05)。MDA作為膜脂質過氧化物最重要的終產物，其含量反映了機體脂質過氧化程度，間接反映肝細胞的受損程度。乙醇過量會誘導NF-κB等轉錄因子的磷酸化和核轉位，促使一些細胞因子的釋放，如IL-1β和IL-6等。NF-κB是細胞中重要的轉錄因子，與炎性介質的轉錄表達和免疫反應的調控相關。當細胞處于正常狀態時，NF-κB在胞漿中處于非活性狀態，當細胞受到一些外部刺激如缺氧、氧化應激、炎癥反應時，NF-κB均可被激活[19,20]。NF-κB會從胞漿中進入細胞核，從而使細胞核NF-κB明顯增多。核NF-κB激活后會激活其他信號通路的相關蛋白，進而引起級聯放大效應，會使人體出現更多的后續反應。為了考察miR-203的抗炎作用機制，我們采用Western Blot法檢測了促炎因子IL-1β和核轉錄因子NF-κB水平，結果C組大鼠肝細胞NF-κB和IL-1β表達顯著低于B組，實驗結果提示miR-203與NF-κB和IL-1β相關的炎癥反應有關。

綜上所述，miR-203過表達對ALD動物肝損傷有明顯的保護作用，其可能是通過抗氧化和抗炎作用，從而對ALD起到了保護作用。