非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織Vaspin表達及其意義探討*

姜佳麗，李 莉，趙 菲，鐘樂萍，郭子皓，張 川，展玉濤

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是除外酒精及其他損肝因素所致的以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，主要包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎以及相關的肝硬化和肝癌[1-4]。據統計，全球NAFLD平均患病率為25.4%，我國NAFLD患病率也高達20.1%[5-8]。單純性脂肪肝為良性病變，進展緩慢，但大約20%脂肪性肝炎在10年內可進展為肝硬化，甚至部分NAFLD患者可進展為肝細胞癌。NAFLD已經成為重要的公共衛生問題。因此，加強NAFLD的防治研究非常重要。研究發現，NFALD發病與肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關，但確切發病機制仍不明確[1]。近年研究發現，多種脂肪因子在NAFLD發病過程中起重要作用[2-5]。內臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor，Vaspin)是新近從肥胖大鼠內臟脂肪組織分離的一種脂肪因子，是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員，主要表達于內臟和皮下脂肪組織，但其在NAFLD個體肝組織的表達狀況尚不清楚[6,7]。本研究采用免疫組織化學法和Western blot法檢測了NAFLD大鼠肝組織和體外培養的脂肪變性肝細胞Vaspin蛋白表達情況，以期發現Vaspin在NAFLD發病中的作用，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物、細胞與試劑 12只SPF級Sprague-Dawley(SD)健康雄性大鼠，3月齡，體質量150～180 g，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心【許可證號：XCXK-(軍)2007-0040】，飼養于首都醫科大學實驗動物中心。分籠喂養，自由攝食飲水，每日明暗時間均為12 h，室溫23～26℃，濕度為50%左右，飼養環境清潔，通風良好。HepG2細胞購自深圳市百恩微生物科技有限公司，高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司，抗Vaspin抗體購自上海莼試生物技術有限公司(批號CS4593)。

1.2 脂肪肝模型的制備 采用隨機數字表法隨機將12只SD大鼠分為模型組6只和對照組6只。給予模型組動物高脂飲食(Lieber-DeCarli 液體高脂飲食，能量分配：70%脂肪，11%碳水化合物，18%蛋白質)，飼養7 w；在對照組，給予標準飲食(能量分配：35%脂肪，47%碳水化合物，18%蛋白質)飼養7 w。在實驗結束時，處死實驗大鼠，取肝組織，用10%甲醛緩沖液固定，然后進行脫水、石蠟包埋、切片、常規HE染色，顯微鏡下觀察。采用常規免疫組織化學法，抗體濃度為1:50，以正常肝組織作為陰性對照，以脂肪組織作為陽性對照，染色，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。結果判定：細胞質或細胞膜染色呈棕黃色為陽性。

1.3 脂肪變性肝細胞模型的建立 取HepG2細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養基培養于37℃，5%CO2的細胞培養箱。待細胞達到70%～80%融合時，消化傳代，24 h后換液。實驗分為正常組和脂肪變性組。在正常組，按上述方法培養換液，在脂肪變性組，在換液時換成終濃度為100 μM油酸(OA)的完全培養基，誘導72 h，收集細胞。

1.4 脂肪變性細胞Vaspin表達檢測 采用Western blot法，收集體外培養的細胞，加入適量的細胞裂解液和等量的2×Sample buffer，混和，100℃沸水煮10 min，行SDS-PAGE電泳。切下含目的條帶的SDS變性膠，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，進行電轉移。隨后，在含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉60 min。加一抗(1:200) ，4℃孵育過夜，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。然后，與耦聯HRP的二抗(1:1000)室溫孵育1 h，最后用TBST洗膜3次后，加入底物化學發光試劑，于暗室內進行X光片曝光、顯影。

2 結果

2.1 肝組織病理學改變 對照組大鼠肝組織小葉結構正常，無細胞變性壞死，肝細胞索排列規整；模型組大鼠肝組織肝細胞腫脹，細胞質內可見較多的脂滴(圖1)。

圖1 兩組大鼠肝組織學表現 (HE，400×)

2.2 兩組肝組織Vaspin表達情況比較 在模型組，可見肝細胞脂滴表面Vaspin表達增強，主要表達于脂滴周圍，呈深棕色，而對照組則呈陰性(圖2)。

圖2 肝組織Vaspin表達情況 (Sp，400×)

2.3 兩組HepG2細胞Vaspin蛋白表達情況 在體外培養的肝細胞，結果顯示脂肪變性肝細胞和對照組細胞Vaspin/GAPDH表達分別為(0.49±0.70)和(0.68±0.40)，差異具有顯著性 (P<0.05，圖3)。

圖3 兩組細胞Vaspin表達情況

3 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高以及肥胖和糖尿病人口的不斷增加，NAFLD的發病率逐年升高，NAFLD已成為當今世界最常見的慢性肝病[9]。盡管NAFLD的詳細發病機制目前尚不明確，占主導地位的是二次打擊學說，即第一次打擊為代謝異常引起的胰島素抵抗，脂質代謝異常引起脂肪在肝細胞內過多聚集，從而導致肝細胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝。第二次打擊為在第一次打擊的基礎上，出現氧化應激、細胞凋亡、脂肪因子和炎癥因子分泌，促進脂質過氧化物的產生。第二次打擊可導致肝細胞損傷和凋亡，引起肝臟炎癥的發生，形成脂肪性肝炎。肝臟炎癥進一步激活肝臟星狀細胞，產生大量的細胞外基質，逐漸形成肝纖維化和肝硬化[10-12]。在此學說中，脂肪因子在脂肪性肝炎發生過程中起重要作用。已經證實，脂肪組織是一個活躍的內分泌器官，能分泌多種具有生物活性的脂肪因子，包括瘦素、脂聯素、內脂素和Vaspin等，其異常表達與胰島素抵抗或糖脂代謝有關，它們可通過多種途徑使脂肪組織釋放更多的游離脂肪酸，增多的游離脂肪酸被肝臟攝取，導致NAFLD的發生[14]。

Vaspin是由Hida et al近年從OLETF大鼠(一種2型糖尿病模型動物，具有腹型肥胖、胰島素抵抗、高血壓、高血脂等特征)的內臟脂肪組織中分離得到的一種脂肪因子，具有典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑的特點，其異常表達與胰島素抵抗有關[14,15]。研究發現，Vaspin能夠增加肥胖小鼠腹部內網膜白色脂肪組織和皮下白色脂肪組織葡萄糖轉運因子4和脂聯素的表達，抑制瘦素、抵抗素和TNF-α的表達，推測Vaspin可能通過參與調控胰島素抵抗相關基因表達，而胰島素抵抗是NAFLD發病的重要因素，因此我們推測Vaspin可能與NAFLD的發病有關。關于Vaspin與脂肪肝的關系，目前存在爭議，多數研究表明血清Vaspin水平增加可能與NAFLD發生有關[3，16]，但也有少數研究認為血清Vaspin與NAFLD發生無關[17]。血清Vaspin水平受多種因素的影響，不能完全反映Vaspin在NAFLD動物肝組織尤其是肝組織脂肪變性細胞中的表達情況，但是目前尚未發現關于Vaspin在脂肪肝組織中的表達研究。故本研究采用免疫組織化學法和Western blot法檢測了NAFLD大鼠肝組織和體外培養的脂肪變性肝細胞Vaspin蛋白表達情況，以期發現Vaspin在NAFLD發病過程中的作用。

本研究采用Lieber-DeCarli液體高脂飲食飼養SD大鼠，成功制備NAFLD模型。NAFLD 模型的制備方法有多種，其中Lieber et al應用高脂飲食和自由取食方法建立的NAFLD 模型與臨床上NAFLD 患者的情況有相似之處，而且這種方法可以復制非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大部分肝臟病理學特征。Lieber-DeCarli 液體高脂飲食中多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量均較高，分別為 42%和 41%。另外，這種高脂飲食的成分都是較易購買到的，并且模型制備的時間也相對較短。因此，本實驗采用了Lieber-DeCarli 液體高脂飲食方法制備NAFLD 模型。我們應用 Lieber-DeCarli 液體高脂飲食飼養 SD 大鼠 7 周，結果發現，模型組大鼠肝臟出現了NAFLD 的病理學變化，大部分肝細胞出現了脂肪變性，肝組織有氣球樣變的肝細胞。因此，我們的研究結果也證實，應用Lieber-DeCarli 液體高脂飲食飼養SD 大鼠能成功制備NAFLD 動物模型。

本研究中我們采用免疫組化方法檢測肝組織Vaspin表達，結果發現模型組大鼠脂肪肝組織Vaspin表達增強。人原代培養肝細胞是人類肝臟細胞的適宜模型，人類肝細胞來源的細胞系HepG2具有類似人原代肝細胞的特征，并且易于獲得和培養。我們在HepG2細胞，通過體外實驗直接研究脂肪變性的HepG2細胞Vaspin表達情況，結果發現體外培養的脂肪肝細胞Vaspin表達增強，從而支持Vaspin可能與NAFLD發生有關。

通過動物實驗，我們還發現Vaspin主要分布于肝細胞脂滴周圍。脂滴是一種亞細胞結構，由甘油三酯和膽固醇構成脂滴核心，外面附著單層磷脂分子，磷脂單層內鑲嵌多種蛋白，即脂滴相關蛋白。研究發現脂滴相關蛋白種類繁多，有上百種，一般分為三類，即脂滴結構功能蛋白、脂代謝相關蛋白酶和脂滴轉運蛋白。脂滴相關蛋白對脂滴的形成、代謝及其調控起重要作用[18-20]，其中PAT家族蛋白是現在研究最多的蛋白。PAT家族蛋白以脂滴表面為平臺對脂滴內脂質代謝進行調節。脂肪分化蛋白是PAT家族的一員，主要表達于脂肪組織、胰腺、小腸粘膜等。研究發現脂肪分化蛋白可促進肝細胞內甘油三酯以脂滴形式儲存于胞漿，高脂飲食誘發的脂肪肝小鼠脂肪分化蛋白水平明顯升高，而基因敲除小鼠甘油三酯含量明顯降低，具有抗脂肪肝的作用[20]。在本研究，我們發現Vaspin表達于脂滴周圍，推測Vaspin可能是一種脂滴相關蛋白，它對脂滴形成及代謝可能有一定的影響。NAFLD以肝細胞內脂滴形成為主要特征。因此，我們推測Vaspin可能通過影響脂滴形成，從而參與NAFLD的發病，但其詳細作用及其機制有待于進一步研究探明。