非酒精性脂肪性肝病小鼠肝組織與脂質代謝相關基因FAS、ACC和SREBP-1水平分析*

張 猛，陳 晹，劉 嬌，李葉晟，黃楊卿

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是脂肪肝分類中的一種，主要是指在非酒精因素作用下所引起的肝臟實質細胞脂肪變性和脂肪沉積病癥，是代謝綜合征在肝臟的具體表現，主要的病理改變是肝細胞內因代謝障礙而異常堆積的甘油三酯(triglycerides，TG)和異常沉積的總膽固醇(total cholesterol，TCH)。近年來，由于飲食結構和生活習慣等的變化，NAFLD在我國呈逐年上升趨勢，已經逐漸成為發病率第一位的肝臟疾病[1-3]。NAFLD的發生發展是個體、環境和遺傳等多種因素共同作用的結果，涉及到多基因、多環節和多途徑，具體的發病機制較為復雜，至今尚未完全明確。在這些因素中，肝臟的脂質代謝異常被認為是最關鍵的環節之一。膽固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs) 是一類位于內質網上的膜連接蛋白。在肝臟， SREBPs 有3種同型異構體，而SREBP-1在3種同型異構體中含量最高，甘油三酯(TG)的合成和代謝受SREBP-1的轉錄調控[4]。SREBP-1與固醇反應元件 (sterol response element，SRE) 結合后激活下游與脂質合成有關的關鍵酶，如 FAS、ACC1、HMGCoA還原酶等，其中乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme carboxylase, ACC)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A，合成長鏈脂肪酸前體，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)則是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A、參與長鏈脂肪酸生成的內源性蛋白酶[5]。 本實驗旨在通過建立非酒精性脂肪性肝病小鼠動物模型，分析其肝組織脂質代謝相關基因SREBP-1、FAS和ACC水平變化，以探討非酒精性脂肪性肝病與脂質代謝相關基因異常表達之間的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性C57BL/6J小鼠20只，4 周齡，購自安徽醫科大學實驗動物中心，飼養于安徽醫科大學實驗動物中心，適應性喂養1周，保證小鼠能夠自由飲食，維持12 h晝夜交替光照，飼養溫度控制在(25±2)℃，濕度保持在(50±5)%。檢測總膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)；多聚甲醛(上?；瘜W試劑有限公司，中國)；TRIzol 試劑(Invitrogen 公司，美國) 。基礎飼料、高脂飼料和飼養用墊料均購于安徽醫科大學動物實驗中心?；A飼料配方主要為：碳水化合物60%，蛋白質 22%， 粗纖維5.6%，脂肪2.4%，其他 10.0%；高糖、高脂飼料組成：基礎飼料 66.5%，蔗糖 10%，豬油 20%， 膽固醇 3.4%，膽酸鈉 0.1%。SW-CJ-IF型超凈工作臺(蘇州泰安空氣技術有限公司，中國) ；Sigma3-16K 高速離心機(Sigma公司，美國) ；7800 型 PCR 反應擴增儀 (ABI公司，美國) ；Lejca熒光顯微鏡(Lejca公司，德國)；722S分光光度儀(上海緊密科學儀器公司；中國)；LKB-NOVA型超薄切片機(LKB公司，瑞典)；LightCycler 480 分析儀(羅氏公司，美國)。

1.2 NALFD模型的制備 將20只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為正常對照組和NAFLD模型組，每組10只。給予對照組小鼠基礎飼料，給予NAFLD模型組小鼠高糖、高脂飼料，小鼠自由進食，定期監測小鼠體質量。在喂養24 w末，處死小鼠并解剖，收集血清。獲取肝臟組織，取部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察肝組織脂肪變性情況；其余的肝臟組織置于液氮中，用于提取總RNA。

1.3 檢測 用TRI reagent試劑盒，提取肝組織總RNA，加入DNA 酶活化，提取總RNA 2 μg，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法進行逆轉錄反應。采用primer design 軟件設計引物, 由上海生物工程公司合成。內參：18 S上游：5’GTAACCCGTTGAACCCCATT 3’，18 S下游：5’ CCATCCAATCGGTAGTAGCG 3’，擴增片段長度為151 bp；FAS上游：5’CGCTCGGCTCGATGGCTCAG3’，FAS下游：5’CCAGCACCACGGCATGCTCA3’，擴增片段長度為157 bp；SREBP-1上游： 5’ GTGAGGCGGCTCTGGAACAGA

C3’，SREBP-1下游：5’ ATAGGGGGCGTCAAACAGGCC3’，擴增片段長度為134 bp。ACC上游： 5’CCGTTGGCCAAAACTCTGGAGCTAA 3’，ACC下游：5’GAGCTGACGGAGGCTGGTGACA3’，擴增片段長度為149 bp。 使用LightCycler 480 分析儀進行cDNA 擴增反應，95 ℃預變性5 min ，依次行95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s 和72 ℃延伸30 s，設定循環50 次。選擇18 S 作為內參對照，各基因mRNA 水平以其與對照比值表示。

2 結果

2.1 兩組小鼠肝質量的比較 在喂養24 w末，對照組小鼠肝質量為(1.1±0.2)g，NAFLD組小鼠肝質量為(1.6±0.3)g，兩組小鼠肝質量差異有統計學意義(t=4.385,P<0.001)。

2.2 兩組肝組織病理學變化比較 對照組小鼠肝臟組織結構完整，細胞呈放射狀整齊排列，細胞核圓，位于中央，細胞胞質豐富，核膜清晰，肝細胞無脂肪浸潤；在NAFLD模型組，肝細胞排列不整齊，肝細胞內出現大小不等的脂滴，細胞胞質呈現空泡狀，細胞核偏移(圖1)。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學變化(HE，100×)

2.3 兩組小鼠血清TG和TCH水平比較 在實驗24 w末，對照組小鼠血TG水平為(0.28±0.06)mmol/L，TCH水平為(2.78±0.6)mmol/L，而NAFLD組小鼠血TG水平為(0.63±0.13)mmol/L，TCH水平為(7.23±0.7)mmol/L(TG: t=7.731,P<0.001；TCH: t=15.263,P<0.001)，差異顯著(圖2)。

圖2 兩組小鼠血清TG和TCH水平比較

2.4 兩組小鼠肝組織FAS 、SREBP-1和ACC mRNA水平比較 在實驗24 w末，NAFLD組小鼠肝組織FAS 和SREBP-1 mRNA水平分別為(3.9±1.1)和(1.8±0.7)，對照組則分別為【(1.0±0.3)和(1.0±0.4)，FAS:t= 6.231,P<0.001； SREBP-1:t= 2.431,P=0.035】，差異顯著(圖3)；NAFLD組小鼠肝組織ACC mRNA水平為(1.2±0.5)，與對照組【(1.0±0.4)，t= 0.765,P=0.462，圖3】比，無顯著差異。

圖3 兩組小鼠肝組織FAS 、SREBP-1和ACC mRNA水平比較

3 討論

流行病學研究表明，NAFLD已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，發病率為20%～30%，而在肥胖人群中，其發病率更高。目前認為, NAFLD 主要有三個階段, 即單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和肝纖維化階段。更進一步地，可能會進展為肝硬化甚至是肝細胞癌[6-7]。目前，NAFLD的發病機制尚未完全清楚。因此，很多關于其發生機制的研究都基于動物實驗。常用的NAFLD的動物模型有營養失調性模型、藥物中毒模型、基因改良模型和復合性模型等[8]。本研究采用高脂飼料喂養小鼠建立NAFLD模型，該模型的優點是可形成肥胖、代謝綜合征等表現的與人類NAFLD發病機制最相似的經典非酒精性脂肪性肝病，鏡下可見大細胞性脂肪變性、肝小葉炎癥、纖維化等病理改變[8，9]。在本研究中，經高脂飼料喂養24周后，小鼠肝組織肝細胞排列不整齊，肝細胞內出現大小不等的脂滴，細胞胞質呈現空泡狀，細胞核不居中，出現NAFLD樣的病理改變。本研究中，與對照組相比，NAFLD小鼠血清TG和TCH水平顯著上升，與文獻報道一致[10，11]。

SREBP是位于內質網上的膜結合的轉錄因子，可通過調節下游一系列靶基因來參與脂質自穩態的多個方面調節，被認為是調節細胞脂質自穩態的“樞紐”。目前，已經在肝臟組織中發現有3 種SREBP：即SREBP-1( 包括SREBP -1a 和SREBP -1c)和SREBP -2。SREBP -1c構成了體內90%的SREBP-1，而TG的合成和代謝受SREBP -2的轉錄和調控，SREBP -2可特異性激活膽固醇代謝基因[12]。SREBP-1c 前體蛋白在內質網合成后與SREBP 裂解激活蛋白(SCAP)結合，并由其送到高爾基體，分別被位點1、位點2 蛋白酶依次加工，釋放氨基末端片段入核，與其靶基因啟動子的固醇調節元件或E盒結合，即為nSREBP-1c，此活性形式能夠調控與TG 合成相關的靶基因， 如ACC1、FAS、SCD1 等30 多個基因的轉錄過程，因此SREBP-1c被稱為“脂毒性的門衛”[13]。機體通過SREBP精細調節著脂質合成。當SREBP 過度表達時則可引起器官和循環系統中TG和TCH的增高，從而導致器官和外周的脂質蓄積[14，15]。肝細胞中的膽固醇和脂肪酸合成是偶聯的，并且通過膽固醇生物合成途徑的通量是最大SREBP-1c表達和脂肪酸合成的高速率所必需的[16]。FAS是一種多功能復合酶，在合成脂肪酸方面發揮著關鍵的作用，與體內的脂質代謝密切相關[17]。FAS在小鼠肝臟組織中大量表達，特別是在肝細胞的細胞質中。它的表達上升是對內源性脂肪酸合成和細胞增殖的適應。隨著脂類物質攝入的增加，FAS的表達往往上調，FAS基因轉錄增加，導致其活性增強，并引起脂肪酸合成增多和增加，在肝細胞中異常沉積形成脂肪肝[18]。有研究表明，NAFLD大鼠肝臟的FAS水平顯著上調[19]。SREBP-1c、FAS和ACC是調節肝臟脂肪生成的關鍵基因。文獻[20]報道，沉默SREBP-1c的表達可降低脂肪肝的發生率，同時抑制FAS和ACC的表達。本研究發現，NAFLD小鼠肝臟組織FAS 和SREBP-1 mRNA水平均顯著上調，而NAFLD小鼠肝臟組織ACC水平與對照組小鼠無顯著差別。在未來，仍需要更進一步研究來探索在NAFLD發生發展過程中，肝臟脂質代謝相關基因所扮演的角色。

本研究采取高脂飼料喂養建立NAFLD小鼠模型，發現NAFLD小鼠肝臟組織FAS 和SREBP-1 mRNA水平均顯著上調，提示NAFLD小鼠肝臟脂質代謝紊亂，為進一步研究NAFLD的發生發展機制奠定了基礎。