紅禾麻多糖除蛋白除色素方法研究*

唐甜甜，吳 迪，魏 晴，薛 娟，梁珊珊

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

紅禾麻系蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻(Laporteabulbifera(Sieblod & Zuccarini)Weddell.)的新鮮或干燥全草，又名紅合麻、紅活麻、艾麻草、火麻、鐵秤砣[1-2]。紅禾麻為貴州少數(shù)民族民間常用藥，具有祛風除濕、活血化瘀的功效，民間主要用于治療風濕及類風濕性關節(jié)炎，此外，紅禾麻還具有鎮(zhèn)痛、降血脂、免疫抑制等作用[3]。近年來，民間對紅禾麻的需求日漸增長，貴州同濟堂有限公司民族藥“潤燥止癢膠囊”的主要成分即是紅禾麻。隨著用藥量的增長，紅禾麻的化學成分和藥理作用的研究也在逐漸深入，研究發(fā)現(xiàn)，紅禾麻中含有黃酮類、香豆素類、酚酸類、甾醇類、苯丙素類等化合物，鄒淑涵等[1]發(fā)現(xiàn)紅禾麻的地下部分含有大量的多糖成分，而對于紅禾麻中多糖的相關報道甚少。

現(xiàn)代研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗氧化、抗菌抗病毒、保護肝臟等作用[4-7]，而多糖的活性與多糖的純度密切相關。多糖一般采用水提醇沉法進行提取，因此在提取的過程中會夾帶其他水溶性雜質(zhì)，包括色素、無機鹽、單糖、寡糖、高分子蛋白質(zhì)等，為了得到較高純度的多糖，除蛋白和除色素是多糖純化必不可少的環(huán)節(jié)。因此，本實驗以紅禾麻為研究對象，以脫蛋白率、脫色率及多糖損失率為指標考察不同脫蛋白、脫色素方法對紅禾麻粗多糖的影響，為紅禾麻多糖的進一步研究提供實驗依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

紅禾麻，貴州同濟堂有限公司；牛血清白蛋白，考馬斯亮藍G-250，木瓜蛋白酶，成都曼斯特生物科技有限公司；食品級活性炭，河南弘之源凈水材料有限公司；重蒸苯酚，上海研生實業(yè)有限公司；無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、雙氧水、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

721N可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；AB265-S電子分析天平，梅特勒；KDM型調(diào)溫電熱套，山東鄄城晨博實驗設備有限公司；101恒溫鼓風干燥烘箱，紹興市上虞區(qū)道墟恒幸儀器設備廠；N-1300S-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；AXTG16G臺式低速離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅禾麻粗多糖的制備

取紅禾麻干燥粉末過20目篩，稱取80 g粉末置于2000 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇1000 mL，加熱回流提取2次，每次3 h，合并濾液并回收乙醇，烘干藥渣，再加1000 mL蒸餾水，加熱回流提取2次，每次3 h，合并兩次濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/4，加入4倍量的95%乙醇，置于4 ℃條件下醇沉24 h。抽濾得沉淀，并用無水乙醇和丙酮交替洗滌至溶劑無色，烘箱干燥得紅禾麻粗多糖。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的測定

表1 葡萄糖標準曲線數(shù)據(jù)Table 1 Glucose standard curve data

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

采用苯酚-硫酸法測葡萄糖標準曲線。精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖20 mg，加雙蒸水溶解并定容至100 mL容量瓶中，取25 mL溶液，再定容至100 mL容量瓶中，即制得濃度為0.05 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。精密量取0.05 mg/mL葡萄糖標準品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL 及2.0 mL分別置10 mL具塞試管中，加蒸餾水補充至2.0 mL，再分別加6%苯酚試劑1.0 mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL搖勻，放置5 min后，置沸水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫。另以蒸餾水2.0 mL，同上操作為空白對照，于490 nm波長處測定吸光度值。同一濃度的標準溶液分別重復測定3次。以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=0.014x-0.0525，R2=0.9965。詳見表1和圖1。

1.3.3 蛋白質(zhì)標準曲線的測定

參考梁軍[8]蛋白質(zhì)含量測定方法，采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)標準曲線。精密稱取50 mg的考馬斯亮藍G250，溶于25 mL的無水乙醇中，再加入85%的濃磷酸50 mL，用蒸餾水定容至500 mL的容量瓶中，過濾，避光保存。精密量取5.0 mg的牛血清白蛋白，用蒸餾水定容至25 mL的容量瓶中，得到濃度為200 μg/mL的牛血清白蛋白母液。精密量取200 μg/mL牛血清白蛋白準品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5及0.6 mL分別置10 mL具塞試管中，加蒸餾水補充至1.0 mL，再分別加5 mL考馬斯亮藍試劑混勻，于30 ℃恒溫水浴5 min，冷卻至室溫。另以蒸餾水1.0 mL，同上操作為空白對照，在595 nm處測量吸光度值。同一濃度的標準溶液分別重復測定3次。以蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=0.0033x+0.0711，R2=0.9933。詳見表2和圖2。

表2 蛋白質(zhì)標準曲線數(shù)據(jù)Table 2 Protein standard curve data

圖2 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.2 Protein standard curve

1.3.4 脫色率測定方法

在波長300～600 nm范圍內(nèi)測定多糖水溶液吸收值最大的波長范圍，得到在330 nm處吸光度值最大為2.785，故選擇330 nm作為多糖色素的檢測波長，通過測定多糖水溶液脫色前和脫色后的吸光度值計算多糖的脫色率。

1.3.5 計算公式

1.3.6 紅禾麻多糖除蛋白方法考察

1.3.6.1 Sevage法

配制50 mg/mL紅禾麻粗多糖水溶液，參考王筱瑜[9]的Sevage 法除蛋白方法，按照氯仿:正丁醇= 4:1(V/V)體積比例配制Sevage溶液，紅禾麻粗多糖水溶液與Sevage溶液按照4:1(V/V) 體積比例進行混合，置于分液漏斗中，振蕩混勻后靜置20 min，5000 r/min離心10 min，除去有機層與水層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復上述操作步驟5～6次，直至有機層與水層交界處無蛋白質(zhì)后，按照1.3.2和1.3.3方法測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量，按照1.3.5計算多糖的脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.6.2 TCA 法

參考梁軍[8]的TCA 方法除蛋白。取濃度為50 mg/mL的紅禾麻粗多糖水溶液50 mL，加入三氯乙酸至溶液中三氯乙酸濃度為15%，攪拌片刻，放入4 ℃冰箱內(nèi)靜置24 h，取出，5000 r/min離心10 min后，取上清液，按照1.3.2和1.3.3方法測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量，按照1.3.5計算多糖的脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.6.3 酶-Sevage法

木瓜蛋白酶與Sevage法聯(lián)用脫蛋白。按照于曉紅[10]木瓜蛋白酶脫蛋白的方法對預熱后的粗多糖水溶液進行脫蛋白處理，配制50 mg/mL紅禾麻粗多糖水溶液，在37 ℃水浴鍋中預熱10 min，取紅禾麻粗多糖水溶液50 mL，加入其體積0.5%的木瓜蛋白酶，攪拌，60 ℃水浴酶解2 h，100 ℃酶滅活10 min，冷卻，5000 r/min 離心15 min，棄沉淀得上清液，按1.3.6.1所述 Sevage 法對酶解后的紅禾麻粗多糖水溶液再次脫蛋白處理5～6次，取上清液，按照1.3.2和1.3.3方法測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量，按照1.3.5計算多糖的脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.7 紅禾麻多糖除色素方法考察

1.3.7.1 活性炭脫色法

參考林冰梅[11]活性炭脫色法，活性炭置于105 ℃烘箱中活化3 h后，冷卻備用。取10 mL濃度為1 mg/mL的脫蛋白紅禾麻多糖水溶液，加入1%活性炭，置于恒溫55 ℃下震蕩脫色40 min。按照1.3.5計算紅禾麻多糖水溶液的脫色率和多糖損失率。

1.3.7.2 過氧化氫脫色法

取10 mL濃度為1 mg/mL的脫蛋白紅禾麻多糖水溶液，調(diào)節(jié)pH為8，加入10%的過氧化氫溶液，置于恒溫55 ℃下脫色4 h。按照1.3.5計算紅禾麻多糖水溶液的脫色率和多糖損失率。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅禾麻粗多糖含量與蛋白質(zhì)含量測定

經(jīng)水提醇沉法得到的紅禾麻粗多糖中總糖含量為31.88%，蛋白質(zhì)含量為10.85%。

2.2 紅禾麻粗多糖脫蛋白方法考查

由表3和圖3可知，三種脫蛋白的方法中，TCA法清除蛋白的能力最強，脫蛋白的效果最好，其次是木瓜蛋白酶-Sevage法，Sevage法除蛋白效果最差，三種方法的蛋白清除率分別為93.59%、70.60%和65.58%。而三種脫蛋白方法中，木瓜蛋白酶-Sevage法的多糖損失率最低，其次是TCA法，Sevage法多糖損失率最高，多糖損失率分別為23.19%、19.65%和38.19%。由于三氯乙酸是強酸，在除蛋白的過程中對多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，而Sevage法的操作繁瑣，且多糖損失率較高，因此選擇木瓜蛋白酶-Sevage法可作為紅禾麻多糖脫蛋白的方法。

表3 紅禾麻粗多糖脫蛋白方法考查Table 3 Deproteinzation method of polysaccharide from Laportea bulbifera Weddell

圖3 紅禾麻粗多糖脫蛋白方法考查Fig.3 Deproteinzation method of polysaccharide from Laportea bulbifera Weddell

2.3 紅禾麻粗多糖脫色方法考查

由表4和圖4可知，過氧化氫法脫色率高于活性炭法，分別為68.87%和55.60%。而過氧化氫法多糖的損失率高于活性炭法，分別為49.81%和27.84%。由于過氧化氫具有強氧化性，將有色物質(zhì)氧化為無色，并非脫色素，在氧化色素的同時多糖也被氧化分解，多糖損失較大[10]，因此選擇活性炭法作為紅禾麻多糖的脫色素方法。

表4 紅禾麻粗多糖脫色方法考查Table 4 Decolorization method of polysaccharide from Laportea bulbifera Weddell

圖4 紅禾麻粗多糖脫色方法考查Fig.4 Decolorization method of polysaccharide from Laportea bulbifera Weddell

3 結(jié) 論

本文主要考察紅禾麻粗多糖脫蛋白脫色素的實驗方法，通過測定脫蛋白率、脫色率及多糖損失率評價方法的可行性。在脫蛋白實驗中，TCA法清除蛋白的能力最強，但是三氯乙酸會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，影響多糖的結(jié)構(gòu)解析和活性測定，而Sevage法多糖損失率較高，同時操作繁瑣，因此木瓜蛋白酶-Sevage法脫蛋白最佳。在脫色素實驗中，過氧化氫法的脫色率高于活性炭法，但是多糖損失率高于活性炭法，且過氧化氫會氧化分解多糖，破壞其結(jié)構(gòu)，因此活性炭法脫色素最佳。