越桔果實脂溶性成分分析及抗氧化活性研究*

顏 智，劉 剛，李忠榮，邱明華，劉育辰

(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2 中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

越桔(Vaccinium vitis-idaea)又名越橘，為杜鵑花科(Erioaoeae)越桔亞科(Vaccinioideae)越桔屬(Vaccinium sp.)植物，灌木或小喬木，常地生，少數(shù)附生。其果實是一種藍(lán)紫色的小漿果，種子極小，甜酸適口，具特殊香氣，目前已加工成果汁、果酒、果醬等，具有延緩腦神經(jīng)衰老、解除眼睛疲勞、增強(qiáng)心臟功能和防癌的獨特功效[1]。此前已有學(xué)者對高叢越橘[2]、半高叢越橘[3]、矮叢越橘[4]、兔眼越橘[5]等不同類型的越橘果實揮發(fā)性化合物的種類和相對含量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明不同越橘品種間含量存在著較大差異，但都主要以醇類、酯類、萜類和酮類化合物為主。由有學(xué)者對高叢越橘藍(lán)豐、半高叢越橘北春、矮叢越橘美登及野生品種越橘果實進(jìn)行體外抗氧化活性研究，結(jié)果證明4種果實皆有良好的抗氧化活性，在溶液質(zhì)量濃度相同的情況下，4 種越橘果實花色苷溶液的抗氧化活性與花色苷含量呈一定的量效關(guān)系，野生越橘的清除DPPH自由基能力最高[6]。

本研究以越桔(Vaccinium vitis-idaea)果實為材料，經(jīng)正己烷超聲提取脂溶性成分，采用GC-MS技術(shù)測定其揮發(fā)性成分的種類及含量。并以維生素C為陽性對照，對越桔果實的凍干粉提取物進(jìn)行清除DPPH自由基活性測試。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

越桔果實于2016年采自云南省麗江市，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所郭永杰助理研究員鑒定為杜鵑花科越桔屬植物越桔(Vaccinium vitis-idaea)果實，并保存于-4 ℃冰箱內(nèi)；正己烷和甲醇為分析純(20180319)，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；維生素C。

1.2 儀 器

VGT-2120QTD超聲清洗儀，深圳市威固特洗凈設(shè)備有限公司；GC-MS儀(配有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫WILEY、NIST)，美國安捷倫公司。

2 實驗方法

2.1 越桔果實脂溶性成分的提取

稱取50.16 g越桔果實，碾碎，用正己烷超聲萃取兩次，每次100 mL，過濾，合并兩次的過濾液，40 ℃減壓濃縮，提取物干重52 mg，得率0.1%。將提取物溶于1 mL正己烷，進(jìn)樣器吸取5 μL進(jìn)行GC-MS分析。

2.2 越桔果實凍干粉的提取

取越桔果實凍干粉末10.12 g，加50 mL甲醇超聲提取30 min，減壓回收溶劑，提取率9.7%，加分析甲醇配制成5 mg/mL溶液。

2.3 越桔果實凍干粉提取物的抗氧化活性

以0.5 mg/mL維生素C為陽性對照，以2.2中配制的提取液為樣品，進(jìn)行DHHP活性測試。

2.4 色譜條件

DB-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量1.0 μL；柱流量1.0 mL·min-1；分流比：20∶1；進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫條件：初始溫度50 ℃，保持1 min；再以10 ℃·min-1速率升至200 ℃，保持2 min；然后以15 ℃·min-1速率升至270 ℃，保持30 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源：E1+；離子化電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～500 amu。

2.5 越桔果實脂溶性成分定性定量方法

未知化合物質(zhì)譜圖經(jīng)計算機(jī)檢索同時與WILEY、NIST質(zhì)譜庫相匹配，并結(jié)合人工圖譜解析及資料分析，確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的各個化學(xué)成分。按峰面積歸一化法求得各成分相對質(zhì)量百分含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 越桔果實脂溶性的得率及GC-MS分析

共提取得到越桔果實脂溶性成分52 mg，得率0.1%。對脂溶性成分進(jìn)行GC-MS分析，其總離子流圖見圖1。

圖1 越桔果實脂溶性成分的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of liposoluble components in Vaccinium fruit

采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫WILEY、NIST檢索圖1中的各色譜峰，并逐一核對、解析質(zhì)譜圖以確定各組分名稱和分子式；采用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，結(jié)果見表1。由表1可知本研究共分離得到46中脂溶性成分，共鑒定了其中44個組分，占總峰面積的97.28%，相對百分含量較高的化合物是α-香樹精、無羈萜、β-香樹精、西米杜鵑醇、二十四烷，分別占19.18%、13.85%、11.6%、6.24%、6.19%。其中α-香樹精含量最高，是越桔果實脂溶性成分中最主要的化合物。

表1 越桔果實中的脂溶性成分及相對含量Table 1 Liposoluble components and relative contents of the Vaccinium fruit

續(xù)表1

1926.77Tetradecane,2,6,10-trimethyl-0.08914905-56-72,6,10-三甲基十四烷2027.23Hexadecane0.177544-76-3十六烷2127.732-Nonadecanone0.59629-66-32-十九烷酮2228.09Hexanedioicacid,bis(2-ethylhexyl)ester0.553103-23-1己二酸二異辛酯2328.14Tetracosane0.401646-31-1二十四烷2428.67Eicosane,2-methyl-0.6971560-84-52-甲基二十烷2528.78Hexadecanoicacid,2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethylester0.09423470-00-02-羥基-1-(羥甲基)棕櫚酸乙酯2628.90Phthalicacid,di(2-propylpentyl)ester0.121(2-丙基戊基)鄰苯二甲酸二酯2730.00Eicosane,2-methyl-0.7891560-84-52-甲基二十烷2830.7613-Docosenamide,(Z)-1.099112-84-5(Z)-13-二十二碳烯酰胺2930.88unkown0.65未知3031.081,2-Benzenedicarboxylicacid,dinonylester0.14884-76-4鄰苯二甲酸二壬酯3131.30Octadecanal0.3638-66-4十八醛3231.37Phthalicacid,hept-3-ylnonylester0.1453-庚基壬基鄰苯二甲酸酯3331.66Phthalicacid,6-methylhept-2-ylnonylester0.0936-甲基壬基-2-庚基鄰苯二甲酸酯3431.99Tetratriacontane6.19214167-59-0三十四烷3534.00Oxirane,heptadecyl-1.54367860-04-2十七烷基環(huán)氧乙烷3635.01unknown2.065未知3738.301,30-Triacontanediol3.52636645-68-81,30-蜂花烷二醇3839.80Octadecane,3-ethyl-5-(2-ethylbutyl)-0.24955282-12-73-乙基-5-(2-乙基丁基)十八烷3939.99β-Sitosterol0.69583-47-6谷甾醇4041.29β-Amyrin11.603559-70-6β-香樹精4142.81a-Amyrin19.183638-95-9α-香樹精4243.17simiarenol6.2481615-94-7西米杜鵑醇4346.09Lupeol4.859545-47-1羽扇豆醇4446.69D:A-Friedooleanan-3-ol,(3-3.965085-72-3表木栓醇4547.56Friedelan-3-one13.855559-74-0無羈萜4651.70Tricosane-2,4-dione0.89365351-36-22,4-二十三烷二酮

3.2 越桔果實凍干粉的抗氧化活性測試

本實驗以0.5 mg/mL維生素C為陽性對照，以2.2中配制的5 mg/mL的越桔果實干粉粗提物為樣品，進(jìn)行清除DHHP自由基活性測試，實驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在5 mg/mL的濃度下，越桔果實提取物具有一定的清除DHHP自由基活性。

表2 越桔果實凍干粉提取物的清除DHHP自由基活性結(jié)果Table 2 DHHP free radical scavenging activity of freeze-dried extract from fruit of Vaccinium

4 結(jié) 論

本研究通過GC-MS法分析并鑒定了越桔果實脂溶性成分的化學(xué)組成，共分離獲得46個化學(xué)組分峰，鑒定了其中44個組分，占總峰面積的97.28%，以烴類、酯類、萜類和酮類物質(zhì)為主，而其余組分由于質(zhì)譜匹配度過低而無法進(jìn)行確證。2009年張春雨等曾利用GC-MS的方法對半高叢越桔果實進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，共檢測出39種揮發(fā)性成分，其中主要以醇類、酯類、萜類物質(zhì)為主，并依據(jù)貢獻(xiàn)大小確定2-甲基丁酸乙酯和β-芳樟醇是半高叢越桔的特征香氣成分，同年又對高叢越桔果實進(jìn)行分析，確定了2-甲基丁酸乙酯和丁酸乙酯為高叢越桔的特征香氣成分[2-3]。孫海悅等[7]利用頂空固相微萃取技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME/GC-MS) 檢測了矮叢越桔和半高叢越桔十個品種的揮發(fā)性成分，結(jié)果表明29種揮發(fā)性成分中主要以醇類(7%)、酯類(20%)、烴類(28%)、醛類(17%)、酮類(28%)為主，其中酯類的含量最高，乙酸辛酯、3-甲基丁酸乙酯和戊酸乙酯的含量較高對以酯類為主要揮發(fā)性成分的越橘品種香氣品質(zhì)貢獻(xiàn)較大。與上述研究相比，本研究中化合物的種類明顯較多，含量較多的幾個化合物種類也不相同，可能是由于其他研究人員采用的是新鮮果實切片用靜態(tài)頂空方法分析，而本研究則采用保存一段時間的果實并且用正己烷提取分析的方法所造成的差異。另外也可能是因為不同種的越桔果實之間本身化學(xué)組成差異較大而造成實驗結(jié)果的差異。

王化等對篤斯越桔和歐洲越桔的抗氧化活性進(jìn)行研究比較，作者先對提取物進(jìn)行初步純化，鑒定主要成分為花色苷，清除DPPH自由基活性結(jié)果表明在提取物濃度為0.6 mg/mL時其DPPH自由清除率分別為69%和71%[8]。而對越桔清除DPPH自由基活性結(jié)果顯示在提取物濃度為0.6 mg/mL時DPPH自由清除率為39%[9]。本研究采用的是粗提物濃度為5 mg/mL的越桔果實提取物，與陽性對照組0.5 mg/mL的維生素C相比(DPPH自由基清除率77.82%)，DPPH自由清除率為71.71%，具一定的抗氧化作用，可進(jìn)一步開發(fā)利用。