馬尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析*

武 星 胡興峰 陳佩珍 孫曉波 吳 帆 季孔庶

(南京林業大學 林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室 南方現代林業協同創新中心 南京210037)

生長素作為植物體內一種重要的植物激素，對于植物生根有重要作用，其通過極性運輸方式調控植物的生長發育。目前研究表明，生長素的極性運輸在根中主要有2種表現形式： 一是沿中柱細胞向根尖的向頂式運輸； 二是通過皮層細胞及表皮由根尖流向根基的向基式運輸，隨后，通過伸長區表皮層流回中柱細胞，形成循環回流(Kepinskietal.， 2005； 李俊華等， 2006)。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的研究驗證，PIN-FORMED(PIN)蛋白家族是極性運輸中重要的輸出載體(G?lweileretal.，1998)。PIN1是研究較為廣泛的成員之一，在生長素由莖尖流向根尖、維管束分化及不定根的形成過程中至關重要(Frimletal.， 2003)，分布于木質部薄壁細胞、維管束細胞和莖尖分生組織的細胞膜(Vietenetal.， 2005； Paponovetal.， 2005； Blilouetal.， 2005)。在擬南芥的pin1突變體中，生長素極性運輸效率下降(Sabatinietal.，1999)。pin1突變體有根去向重力性、側根發生異常等表型(Frimletal.， 2002a； Maheretal.，1980)，與生長素極性運輸抑制劑NPA處理后的植株表型一致(Frimletal.， 2002b)。

作為我國南方特有的重要樹種馬尾松(Pinusmassoniana)，其播種苗主根性極強而側根數少且不發達，這在一定程度上影響了苗木的質量，最終會影響到造林成效； 同時其無性繁殖時生根難，造成其無性育林舉步維艱，阻礙了良種選育獲取更高增益的進程。可見為了從根本上解決馬尾松的生根問題，有必要研究生長素相關的基因。本研究利用PCR與RACE技術成功克隆了馬尾松PmPIN1基因cDNA全長，并通過在線軟件對PmPIN1基因編碼的蛋白進行生物信息學分析，利用實時熒光定量技術分析PmPIN1基因在馬尾松不同組織中的表達差異； 其次，利用農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)介導法將PmPIN1基因導入至煙草(Nicotianatabacum)中，并對其進行功能分析。本研究將有助于在分子水平上揭示馬尾松的生根機制和探尋有效的促根方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑 試驗材料為實驗室30天生馬尾松實生幼苗、南京林業大學校園內10年生馬尾松及實驗室30天生擬南芥實生幼苗。“RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒”及“新型植物基因組DNA提取試劑盒”均購自天根生物有限公司； 反轉錄試劑盒及同源重組試劑盒購自諾威贊生物有限公司； “Plasmid Maxi Kit”(質粒大提試劑盒)購自QIAGEN公司； “植物原生質體制備及轉化試劑盒”購自中科瑞泰生物有限公司； pEASY-T1、pEASY-Blunt載體、大腸桿菌感受態購自全式金生物有限公司； 16318-hGFP載體購自西安淳風生物科技有限公司； 高保真GXL酶及NcoⅠ、SalⅠ、BamHⅠ限制性核酸內切酶、RACE試劑盒均購自Takara生物有限公司； EHA105農桿菌感受態購自上海唯地生物技術有限公司；pCAMBIA-1302真核表達載體由實驗室保存； PEG4000購自Sigma公司； 纖維素酶、離析酶購自Yakult公司； PBS緩沖液購自上海捷瑞生物技術有限公司； DAPI、CM-DiI染色劑購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 馬尾松PmPIN1基因的克隆 在NCBI網站查詢PIN1基因，并與實驗室的馬尾松轉錄組數據(National Omics Data Encyclopedia： OEZ004657)比對，得到馬尾松PmPIN1基因核苷酸序列。利用“RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒”提取馬尾松幼苗全株的RNA，提取步驟參照其說明書，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，NanoDrop超微量分光光度計測定RNA濃度與OD值，為保證RNA質量，試驗器具均經高溫處理，塑料器材為一次性無菌無酶，試驗操作過程避免RNA酶對其影響。用反轉錄試劑盒反轉得到cDNA模板。根據PmPIN1序列，利用Primer5.0設計特異性引物F1、R1、3′RACE Primer、5′RACE Primer，并以cDNA為模板，對馬尾松PmPIN1基因進行PCR擴增，切膠回收目的條帶，將目的片段連接至pEASY-T1或pEASY-Blunt載體上，轉化至大腸桿菌感受態中，將陽性克隆送去測序，利用DNAMAN軟件將測序片段進行拼接獲得基因全長。引物序列見表1。利用在線軟件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析PmPIN1蛋白的親水性，利用生物信息學軟件MEGA5.1對不同物種的PIN1氨基酸序列構建系統進化樹。

1.3PmPIN1基因的實時熒光定量分析 利用高枝剪剪取10年生馬尾松1年生枝條、新葉、花，挖取其新生幼根，迅速清水沖洗干凈，濾紙吸凈表面水分后液氮凍存。利用“RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒”分別提取幼根、1年生枝條、新葉、花的RNA，用反轉錄試劑盒反轉獲得cDNA模板。以Actin2為內參基因，利用在線軟件Primer3.0設計特異性引物F2、R2，Actin2-F、Actin2-R，并以 cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應。生物學重復為3次，試驗重復為5次； 根據公式ΔΔCt=ΔCt(實驗)-ΔCt(對照)及RQ=2-ΔΔCt計算出PmPIN1在不同組織中的表達量，利用SPSS軟件分析顯著性差異，用Origin8.0軟件作圖。

1.4 真核表達載體的構建及轉基因苗鑒定 利用在線軟件CE-Design設計含NcoⅠ酶切位點的引物pCAMBIA-1302-PmPIN1F、pCAMBIA-1302-PmPIN1R，為使目的片段與GFP連接后表達順利，設計引物時加保護堿基T，以cDNA為模板，克隆了含有酶切位點的目的片段； 并用NcoⅠ內切酶單酶切切割pCAMBIA-1302載體； 連接得到真核表達載體pCAMBIA-1302-PmPIN1，將其轉化至農桿菌EHA105中，搖菌至OD≈0.6時，利用葉盤法侵染至繼代培養的野生型煙草中，通過分化、壯芽、生根培養后，移栽至營養土中，用轉pCAMBIA-1302空載煙草作為表型觀察對照。利用“新型植物基因組DNA提取試劑盒”提取轉基因與野生型煙草的DNA，具體步驟參照其說明書，設計特異性引物F3、R3進行分子水平上檢測； 利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉基因煙草根中PmPIN1-GFP蛋白的表達。

1.5 生長素含量測定 利用酶聯免疫法測定轉基因及野生型煙草不同部位的生長素(IAA)含量； 將等量不同濃度的NPA(1-N-萘基鄰氨甲酰苯甲酸)(0、0.4、2、10 nmol·L-1)溶液注射在3 cm×3 cm大小脫脂棉上，將其包裹于轉基因與野生型煙草的根莖結合處，另用保鮮膜纏繞，試驗重復3次。10天后取下脫脂棉，利用酶聯免疫法測定煙草根、根莖結合處、葉中的生長素含量。

1.6 亞細胞定位分析 將30天生擬南芥葉片切成1 mm寬小條，利用“植物原生質體制備及轉化試劑盒”獲得擬南芥原生質體，具體步驟參照其說明書。用SalⅠ、BamHⅠ內切酶線性化16318-hGFP； 利用CE-Design設計引物16318-hGFP-PmPIN1F、16318-hGFP-PmPIN1R(表1)，以cDNA為模板，PCR獲得含SalⅠ、BamHⅠ酶切位點的目的片段，連接獲得16318-hGFP-PmPIN1重組載體(圖1)，轉化至大腸桿菌(Escherichiacoli)，經菌檢、測序，從公司返還測序正確的大腸桿菌菌液，充分搖菌，利用“Plasmid Maxi Kit”獲得高質量重組質粒，具體步驟參照其說明書。利用PEG介導法將16318-hGFP-PmPIN1重組載體轉化至擬南芥原生質體，轉化結束后孵育16 h，DAPI、CM-DiI染色劑侵染10 min，室溫環境PBS清洗2次，每次5 min，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號，進行亞細胞定位分析。為減少細胞破碎，轉化過程盡量輕柔。

圖1 16318-hGFP-PmPIN1融合表達載體示意Fig.1 Schematic diagram of 16318-hGFP-PmPIN1 fusion expression vector

表1 PCR所用引物Tab.1 Primer sequence used in PCR

圖2 PmPIN1蛋白跨膜預測Fig.2 The prediction of transmembrane of PmPIN1 proteins峰值代表跨膜結構域。The red peak represents the transmembrane domain.

2 結果與分析

2.1 馬尾松PmPIN1基因全長的克隆 利用PCR與RACE 技術從馬尾松中克隆出PmPIN1基因全長cDNA，長度為2 914 bp，ORF為2 085 bp，其編碼蛋白的分子量是76.32 kDa，等電點(pI)是9.27。在線軟件TMHMM對PmPIN1蛋白的親水性進行分析，該蛋白是親疏性相間蛋白，中間以親水性為主(圖2)，并且N端與C端均有膜運輸蛋白，由此推測PmPIN1蛋白是膜蛋白。

2.2PmPIN1基因編碼氨基酸序列分析 利用NCBI中的Blastp比對PmPIN1基因編碼的氨基酸序列，結果顯示，馬尾松PmPIN1與油松(Pinustabulaeformis)相似度為99%，與花旗松(Pseudotsugamenziesii)、金松(Sciadopitysverticillata)的相似度分別為68%、66%。根據PmPIN1基因編碼氨基酸序列的比對結果，選取多個物種的PIN1基因編碼的氨基酸序列構建系統發育進化樹(圖3)。結果顯示，馬尾松與油松在同一支上，說明目前馬尾松PmPIN1與油松PIN1親緣關系最近，并且馬尾松與水松(Glyptostrobuspensilis)、金松、羅漢柏(Thujopsisdolabrata)親緣關系較近。PIN1基因在裸子植物與被子植物中均存在，進一步說明PIN1基因進化上的保守性。

圖3 PmPIN1與其他物種PIN1基因系統發育樹的分析Fig.3 The analysis of phylogenetic tree based on amino acid sequences of PmPIN1 gene from Pinus massoniana and other plants

2.3PmPIN1基因的實時熒光定量分析 2018年4月采取10年生馬尾松幼根、1年生枝、新葉、花4個不同組織樣品，并在4個組織中做PmPIN1基因的實時熒光定量分析試驗(圖4)。PmPIN1基因在幼根、1年生枝、新葉、花中的表達量差異達到極顯著，在1年生枝中表達量最高，幼根中次之，約是在1年生枝中的0.75倍，在花中表達量最低。

圖4 PmPIN1基因組織特異性表達Fig.4 The expression quantity of PmPIN1 gene in different tissues of Pinus massoniana不同小寫字母表示顯著差異(P﹤0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4pCAMBIA-1302-PmPIN1真核表達載體的構建與轉基因煙草的檢測 1)pCAMBIA-1302-PmPIN1真核表達載體的構建 選取pCAMBIA-1302載體上NocⅠ酶切位點，利用CE Design V1.04軟件設計含有NocⅠ酶切位點的特異性引物，擴增含有NocⅠ酶切位點PmPIN1的ORF目的片段與線性化載體。切膠回收目的片段與單酶切載體，利用DNA連接酶連接構建出pCAMBIA-1302-PmPIN1真核表達載體(圖5)。

2) 轉基因煙草分子水平上檢測 組培苗移栽至營養土中約30天左右時，提取轉基因與野生型煙草的DNA，選取pCAMBIA-1302載體與PmPIN1的連接序列，利用Primer3.0設計特異性引物，PCR反應檢測后，得到32株轉基因植株，轉基因煙草擴增出目的條帶462 bp，野生型則沒有(圖6)。

3) 轉基因與轉pCAMBIA-1302空載煙草表型對照 分別移栽T0代轉pCAMBIA-1302-PmPIN1煙草與轉pCAMBIA-1302煙草組培苗，約20天時，觀察二者的表型差異，轉基因煙草較轉空載植株高大，節間增長(圖7)； 轉空載植株發根量較少，且根長不及轉基因植株(圖8)。

4) 轉基因煙草GFP熒光檢測 利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察轉基因及野生型煙草根部的PmPIN1-GFP熒光信號。發現野生型有微弱的自發熒光，而轉基因煙草根部中間部位有明顯的熒光富集現象，且在細胞周圍表達明顯(圖9)。

圖5 PmPIN1-GFP融合蛋白表達載體示意Fig.5 Schematic diagram of PmPIN1-GFP fusion protein expression vector

圖6 轉基因及野生型煙草基因組PCR檢測Fig.6 Genome PCR identification of transgenic and wild tobacco 1-2: 野生型; 3-10: 轉基因。1-2: Wild;3-10: Transgenic.

圖7 轉基因與轉空質粒煙草20天的長勢Fig.7 The growth of transgenic and transgenic plasmid tobacco after 20 days

圖8 轉基因與轉空質粒煙草株高與根系對照Fig.8 Comparison between plant height and root system of transgenic and transgenic plasmids tobacco

圖9 轉化型與野生型煙草的GFP熒光觀察Fig.9 GFP fluorescence detection of transgenic and wild tobaccoA: pCAMBIA-1302-PmPIN1; B： pCAMBIA-1302-PmPIN1根部分生區細胞 Cells in the root meristem zone.

2.5 生長素含量分析 1) 轉基因與野生型煙草生長素含量測定 IAA酶聯免疫測定轉基因與野生型煙草根、根莖結合處、葉不同部位的生長素含量(表2)。結果表明，轉基因煙草與野生型不同組織中生長素含量均未達到極顯著差異，轉基因煙草的根、根莖結合處的生長素含量高于野生型，葉中相反。

2) 不同濃度NPA處理后生長素含量變化 不同濃度NPA處理轉基因與野生型煙草的根莖結合處，測定不同部位的生長素含量差異(表2)。測定結果顯示，不同濃度NPA處理后，轉基因煙草根、根莖結合處、葉中生長素含量變化均未達到極顯著。而野生型煙草根中生長素含量變化達到極顯著，且隨NPA濃度增加，生長素含量減少； 處理濃度為2 nmol·L-1時，根莖結合處生長素含量最大； 處理濃度為10 nmol·L-1時，葉中生長素含量增加最多。

2.6 亞細胞定位分析 利用PEG介導法將16318-hGFP-PmPIN1重組載體轉化至擬南芥原生質體中進行亞細胞定位分析(圖10)。亞細胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布在細胞膜上。

3 討論

在馬尾松人工林營建過程中，由于其主根性強、須根少，移栽時易傷根系，影響到造林成活率，前人通過截根的方式使主根變短且增加須根與菌根量，減少運輸過程中的窩根現象，利于提高造林成活率(伍家榮等， 1994)，但未在根本上解決問題。此外，馬尾松無性繁殖可解決無性系育林問題，從而加快其育種進程，且可保留優良的遺傳性狀，最大程度地獲取遺傳增益。但生根困難一直制約了其進展，也影響到該樹種遺傳轉化體系的構建，阻礙了其分子育種的開展。可見從根本上解決馬尾松生根問題極其迫切。一般認為，最適激素種類和濃度對植物根系的發育起促進作用。在研究馬尾松扦插生根試驗中，采用自制的復配型生根調節劑，獲得顯著的生根效果(季孔庶等， 2001)。在組培快繁過程中用0.2 mg·L-1NAA處理馬尾松無性系，其中GLM-80無性系生根效果最佳，且移栽成活率較高(姚瑞玲等， 2016)。分子水平的研究可從源頭上分析根系發育過程，為從根本上解決馬尾松實生苗根系不夠發達問題，并攻克其組培不易生根及難以搭建轉基因平臺等難題提供理論基礎。已有涉及馬尾松生根相關基因的研究表明，PmTIR1在幼嫩馬尾松根中表達量較高(蘇江等， 2015)，PmSHR、PmSCR、PmPIN2基因在成年馬尾松根中表達量最高(朱沛煌， 2016； 武星等， 2018)。本研究發現PmPIN1基因在10年生馬尾松1年生枝與幼根中均較高，PmPIN1-GFP熒光蛋白在轉基因煙草根部中間部位有明顯的熒光富集，PmPIN1轉基因煙草呈現發根量增加的表型，說明PmPIN1基因可能參與根系發育過程。

表2 NPA對 PmPIN1轉基因與野生型煙草生長素含量的影響①Tab.2 The effect of NPA on the content of auxin in PmPIN1 transformed and wild tobacco

①表中數據為3個重復的平均值±標準誤，同列數據標有不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。The data in the table is mean value±standard error of 3 replicates, and the same column of data marked with different letters indicates significant difference (P<0.05).

圖10 PmPIN1蛋白亞細胞定位Fig.10 Subcellular localization map of PmPIN1 proteinsa,g: 明場; b,h: DAPI染核; c, i: CM-DiI染膜; d,j: GFP; e,k: GFP+DAPI; f,l: GFP+CM-DiI。a,g: Bright; b,h: DAPI stained cell nucleus; c,i: CM-DiI stained cell membrane; d,j: GFP; e,k: GFP+DAPI; f,l: GFP+CM-DiI.

生長素在植物根系形態建成過程中至關重要。早期的研究表明，生長素可通過增加側根、不定根量影響根系發育(Woodwardetal.， 2005)。生長素是一種具有極性運輸性質的植物激素，生長素的極性運輸是指其流動方向不受重力作用，從形態學上端流向下端(倪為民等， 2000)。PIN蛋白是一類公認的生長素輸出載體，在生長素由細胞內向外運輸的過程中至關重要。研究發現，pin突變體有生長素運輸異常的表型(G?lweileretal.,1998； Chenetal., 1998)； PIN蛋白的時空表達與生長素的運輸方向一致(Peeretal.， 2004)； PIN蛋白運輸形成的生長素濃度梯度在側根發育過程中起關鍵作用(Benkováetal.， 2003)。在生長素的極性運輸過程中，NPA結合蛋白(NBP)受肌動蛋白的協助，影響輸出載體PIN蛋白的分布與運輸(Mudayetal.， 2002)，NPA是一種常見的生長素運輸抑制劑，其通過與運輸載體結合的方式改變蛋白質的空間結構，進而影響載體與生長素的結合位點。芽孢桿菌(Bacillus)侵染擬南芥，表現出主根伸長、側根量增多，8 μmol·L-1的NPA處理可解除芽孢桿菌的促進作用(Pérez-Floresetal.， 2017)； NPA處理野生型水稻(Oryzasativa)，根中生長素響應報告基因DR5∷GUS在根尖集中表達，在中柱沒有藍色信號，NPA處理OsPIN2超表達水稻時，藍色信號分布沒有發生變化(陳贏男， 2012)。本研究通過酶聯免疫(IAA)測定發現轉化PmPIN1煙草的根和根莖結合處的生長素含量高于葉； NPA處理野生型煙草，不同組織生長素含量變化明顯，且根中出現極顯著變化； NPA處理PmPIN1轉基因煙草，不同組織生長素變化均不明顯，說明PmPIN1轉基因煙草可減少NPA對植物體內生長素分布的影響，表明PmPIN1調控生長素的極性運輸，此結果與PIN家族的研究結果(陳贏男， 2012)一致。 PIN1蛋白結構研究表明，其由中間較長親水區域與兩端疏水區域構成，定位在細胞膜上(Zazímalováetal.， 2007)。菊花(Chrysanthemummorifolium)CmPIN1蛋白的跨膜預測表明其N端與C端為跨膜區，中間為親水區； 亞細胞定位表明其定位于細胞膜上，屬于膜蛋白(呂素慧等， 2016)。水稻OsPIN1(Xu， 2005)與擬南芥AtPIN1(Paponovetal.， 2005； Kreceketal.， 2009)中均有相同結論。本研究預測PmPIN1蛋白的跨膜結構，并對其進行原生質體亞細胞定位分析，得出PmPIN1是膜蛋白，說明PIN蛋白在不同物種中具有保守性。

4 結論

本研究克隆了馬尾松PmPIN1基因，基因全長2 914 bp，包含2 085 bp的ORF。PmPIN1蛋白N端與C端都存在膜運輸蛋白，預測PmPIN1屬于膜蛋白，與亞細胞定位結果一致。PmPIN1在被子植物與裸子植物中均存在，表明PmPIN1基因進化上的保守性。PmPIN1基因在幼根與1年生枝條中表達量較高，進一步驗證PIN1蛋白參與維管束及側根形成的過程。轉基因煙草根、根莖結合處生長素含量高于野生型，葉中相反； 不同濃度NPA對煙草根莖結合處處理時，野生型煙草不同部位的生長素含量均隨NPA的濃度變化而發生明顯變化，轉基因煙草無明顯變化。轉基因煙草生長勢優于轉pCAMBIA-1302空載植株，且發根量增加； PmPIN1-GFP綠色熒光蛋白富集在轉基因煙草根部中間部位。綜上可見，PmPIN1在根生長發育過程中起一定作用。其具體作用將有待進一步的深入分析。